吸光光度法及722 型分光光度计的使用

一：吸光光度法
基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。

（一）吸光光度法及722型分光光度计的使用光线：
光线的波长：200nm-400nm 紫外线*
400-750nm可见光*>750nm 红外线
光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。

（二）物质的吸收光谱及颜色：
1．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的*外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为
激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。
2．可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的
光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。

（三）光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则：
Io=It Ia Ir。那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。
1．Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b
k2 为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度（又称光密度
O.D 或消光度E），当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A 与b 成正比。
2．Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:
A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k4c
k2 为常数。由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A 与c 成正比。
3．Lambert-Beer 定律：综合1.2.得：A=Kbc ,
即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A 与b、c 成正比。

（四）吸光光度法的基本原理：
1、不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同（如：CuSO4），在测定不同颜
色的物质浓度时要用*大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度*高。
2、同一种物质，若浓度不同，则对同一波长的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比关系。
3、
应此，利用特定波长的单色光（通常用*大吸收波长的入射光）照射不同浓度的某一溶液时，所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。

（五）吸光光度法特点：
1．灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。
2．准确度高：误差2-5%
3．操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。

二：分光光度计的使用：
（一）分光光度计的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的单色光
来测量未知溶液的浓度的方法。

（二）常用分光光度计：可见光、紫外、红外分光光度计，
荧光分光光度计，火焰分光光度计等。

（三）722 型分光光度计的使用及注意事项
1、插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。
* 注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。
2、将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。
* 注意：手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满2/3 即可，不得将比色杯放在仪器上。
3、调节所需波长，灵敏度调至“1”，选择旋钮至“T”。
4、调“0”：打开暗箱盖，用调“0”旋钮调节。
5、调“100%”：盖上暗箱盖，用调“100%”旋钮调节，让光线通过“空白管”。
6、重复调“0”和调“100%”数次。
* 注意：若调不到“0”和“100%”，可将灵敏度调至“2”或更高，不得用力强行旋转旋钮，以免损坏。
7、将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至“0”，若不为“0”，可用“消光零”旋钮调节。
8、拉动拉杆，分别读取“A 标”和“A 样”。
9、取出比色杯，弃去溶液，洗净晾干，备用。

（四）计算
1．利用标准管计算测定物含量：
A 样=K 样b 样c 样
A 标=K 标b 标c 标
因为入射光的波长，溶液性质和温度以及比色杯的
厚度都一样，即：K 样=K 标 b <