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DNA测序服务|实验技术服务

关键词:DNA测序服务|实验技术服务
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测序实验流程：
DNA测序技术，即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。
该成果实现了与国际主流设备性能相当的国产化DNA测序能力，在基因组学、生物信息学，乃至生命科学诸多方向的基础研究和应用研究方面具有重要实用价值。
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:
(1) 样品反应:
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液 5ml
引物 4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
(2)对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2 O 至终体积 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择*佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:
模板种类/长度模板量
200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp(超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式:
4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数
计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式:
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数
3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1:适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟。然后: 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)
模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。

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