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IP和Co-IP服务|实验技术服务

关键词:IP和Co-IP服务|实验技术服务
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测序实验流程：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
具体操作：
收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， *大转速离心30 min后取上清；
取少量裂解液以备western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°c缓慢摇晃孵育；
取10μl protein a 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
将预处理过的10μl protein a 琼脂糖珠加入到和抗体孵育的细胞裂解液中4°c缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein a琼脂糖珠偶连；
免疫沉淀反应后，在4°c 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；*后加入15μl的2×sds 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
sds-page, western blotting或质谱仪分析。
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以*大速度离心15 ；
3．收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。*后，用NETN洗一次；
6．吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳；
8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1 ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；
10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；
11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

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