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Northern Blot|实验技术服务

关键词:Northern Blot|实验技术服务
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Northern Blot|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
一、试剂准备
1. 0.5M EDTA：EDTA 16.61g加ddH2 O至80ml，调pH至8.0，定容至100ml。
2． 50mM NaAc：NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml，加DEPC 0.5ml，振荡，37℃高压灭菌。
3． 5×甲醛凝胶电泳缓冲液：MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml，用2N NaOH调pH至7.0，再加入0.5M EDTA 10ml，加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。
4． 20×SSC：NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC：20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6．50×Denhardt：聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml，无菌抽滤、分装。
7．1M Na2HPO4：Na2HPO4-12H2O 35.81g，加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4： NaH2PO4-2H2O 15.6g，加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6)：Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液：1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml，0.5M EDTA，0.5ml，5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.预杂交液：20×SSC 5ml，甲酰胺10ml，50×Denhardt 4ml，1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6），10%SDS 1ml，总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml），使终浓度为4μl/ml。
12. DEPC H2O：1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃高压灭菌。
二、操作步骤
1. 总RNA提取。
2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备：取总RNA4.5μl(约20-30μg) ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：
① 按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。
② 用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。
③ 将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
④ 用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
⑤ 在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。
⑥ 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。
⑦将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。
7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。
8.将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。
10. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
① 取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
② dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
③ 将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
11. 预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr。
12. 杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
13. 洗膜：
① 倾去杂交液。
② 2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。
③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
14.压片：将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。

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