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多肽合成与修饰技术服务|实验技术服务

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多肽合成与修饰技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
具体合成由下列几个循环组成：
1）去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。
2）激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
3）洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。
试剂检测：没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户，也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
用线型梯变以每分钟 0.5% 到 1.0% 改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为 4.6× 250mm (3-10μ m) 和 22× 250mm (10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是 8×100 ( 3-10μ m )和 25× 250mm (10μ m)大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如 heptafluorobutyric 酸， 0.1% 磷酸，稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10 -100mM NH4HCO3, 醋酸钠 / 氨， TFA/TEA ，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高 pH ，甚至微碱 pH ，因为这样会破坏柱子一般多肽分离拿150mm的柱子就可以了，250mm在分离度上改善不大，因为多肽的分离机理和小分子不同。小分子是通过液液交换，所以柱子越长交换越充分，分离度也越高。
Asp和Glu
Asp和Glu侧链羧基常用t-Bu保护.可用TFA、TMSBr等脱除.但是用t-Bu保护仍有侧链环化形成酰亚胺的副反应发生.近年来，发展了一些新的保护基如环烷醇酯、金刚烷醇酯等可减轻这一副反应，这些保护基可用TMSOTf(三氟甲磺酸**硅烷酯)除去.
Ser、Thr和Tyr
ser、Thr的羟基及Tyr的酚羟基通常用t-Bu保护.叔丁基的引入比较麻烦，首先ser制成苄氧羰基酯，再在酸催化下与异丁烯反应.Ser和Thr还可用苄基保护，Ser用苄醇引入苄基、Thr用溴苄引入苄基.
Asn和Gln
Asn和Gln侧链的酰胺键在肽合成中一般不加以保护.但合成大肽时，Asn和Gln的α-羧基活化时可能会发生分子内脱氢反应生成氰基化合物.碱性时Gln的侧链可以环化生成酰胺.而且不保护的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.为了避免这些问题，可以用9-咕吨基，2，4，6-**氧苄基，4，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保护，这四种基因均可用TFA脱除.
His
His是*容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护.
对咪唑环的非π-N开始用苄基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.
对咪唑环π-N保护，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度较差.
Cys
Cys的-SH具有强亲核性，易被酰化成硫醚，也易被氧化为二硫键，必须加以保护.常用保护基有三类:一类用TFA可脱除，如对甲苄基、对甲氧苄基和三苯甲基等;**类可用(CF3CO)3T1/TFA脱除，对TFA稳定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三类对弱酸稳定，如苄基和叔丁硫基(stBu)等，Cys(StBu)可用巯基试剂和磷试剂还原，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脱保护.
Arg
Arg的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个胍基氮原子.保护基分四类:(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.
硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧羰基应主要有Boc和二金刚烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦联反效率不高，理时不处稳定，会发生副反应;Adoc保护了两个非π-N，但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用*广，但它较难脱除.近年来2，3，6-**基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在TFA作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好.
Lys
Lys的ε-NH2必须加以保护.但与α-NH2的保护方式应不同，该保护基要到肽链合成后除去.ε-NH2的保护无消旋问题，可以采用酰基保护基，其它常用的保护基有苄氧碳基
Fmoc基团的脱除
Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应条件很温和.反应过程可表示如下:进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物.Fmoc基团对不同的碱稳定性不同，可根据实际条件选用.
多肽修饰服务：包括同位素标记( 2H, 15N, 13C)、聚乙二醇修饰、多种二硫键修饰、多种磷酸化、KLH、BSA、OVA、多肽的乙酰化、氨基化、甲基化、生物素标记、荧光等修饰。
修饰服务的特点
**的荧光标记基团可选：例如荧光素（Fluorescein），异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine），磺酰罗丹明（Sulforhodamine）， Dinitrophenyl， Dansyl 等
修饰方式牢固：共价键结合，稳定，不易被破坏
修饰方式多样：荧光基团和多肽键之间还可以加入多种功能性linker
修饰位置灵活：N端、C端，或者中间序列均可

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