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基因表达和慢病毒构建包装纯化服务|实验技术服务

关键词:基因表达和慢病毒构建包装纯化服务|实验技术服务
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基因表达和慢病毒构建包装纯化服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
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测序实验流程：
用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。目前常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。
（二）PCR筛选和限制酶酶切法
提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（三）核酸分子杂交法
制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（四）免疫学筛选法
获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
奇妙的克隆克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：
（1）培育优良畜种和生产实验动物；
（2）生产转基因动物；
（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；
（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。
表达策略：1 反向遗传学：克隆的CDS可以亚克隆到特定的表达载体，并转基因到特定的物种（如果本物种的转基因体系尚未建立或很困难，可以先转入一些模式生物），按需要在各种启动子的驱动下在生物体内表达，观察表型；同时可以根据该CDS序列，设计RNAi载体，转基因，观察表型。如果需要，可以克隆该基因本身的启动子，然后让其驱动该基因或RNAi片断表达。
2 体外表达：可以利用大肠杆菌、酵母系统，在体外做一些原核或真核的表达。用以研究酶活，制备抗体等。
基因克隆过程:１、获得待克隆的DNA段（基因）；
２、目的基因与载体在体外连接；
３、重组DNA分子导入宿主细胞；
４、筛选、鉴定阳性重组子；
５、重组子的扩增与／或表达。
材料与方法
1.1　动物和细胞　BALB/c小鼠均为雌性, 5～8周龄,由本校动物中心提供;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0株(H-2d)和人肝癌细胞7721株由本室保存。
1.2　质粒和细菌　pBRTMHCV1-3011质粒［包含除5'非编码区基因(NCR) 外全部HCV基因序列］,由美国Rice教授惠赠;pcDNA3真核表达载体和大肠杆菌菌种JM109由本室保存;质粒制备、含HCV C基因的真核表达重组质粒的构建见文献［2］。
1.3　主要试剂及工具酶　 HCV C抗原由**医学科学院基础所凌世淦教授惠赠;脂质体(Lipofectamine)、酶标抗体及限制性内切酶、连接酶等均购自华美生物公司。
1.4　细胞表达产物的鉴定　将重组质粒pcDNAHCV-C用Lipofectamine 转染法分别转染SP2/0细胞和7721细胞,72 h后收集细胞。SP2/0细胞涂片,以HCV C单抗为一抗做免疫荧光检测;7721细胞用超声断裂后,收集细胞悬液及上清,煮沸10 min,也以HC V C单抗为一抗,Western blot法检测表达的蛋白。
1.5　小鼠免疫及血清抗体水平测定　重组质粒大量提取,PEG纯化。48 只BALB/c小鼠股四头肌注射 0.25%布比卡因100 μl,24 h后分两组,在同一部位肌肉接种质粒。第1组注射100 μg重组质粒pcDNAHCV-C或空载体对照pcDNA3,2 w后,将实验鼠再分成两部分,一部分按以上方法每间隔2 w再次接种同量的DNA,共注射5次,另一部分不再接种; 第2组注射不同剂量50～200 μg的质粒DNA。不同剂量或不同注射次数组均设4只复鼠,小鼠每次接种前24 h均需用0.25%布比卡因100 μl预处理,两组均每间隔2 w剪尾取血。鼠血清1:50稀释后,ELISA法检测HCV C 特异性抗体产生情况。

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