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基因甲基化检测技术服务|实验技术服务

关键词:基因甲基化检测技术服务|实验技术服务
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测序实验流程：
DNA甲基化是*早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。
检测程序
1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化;反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，*后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化.
送样要求
细胞(≥106 个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位点与程度的实验方法有三类：
（1）（M SREs）利用对甲基化碱基敏感的限制性内切酶。该酶不能切割甲基化的碱基位点，从而产生片段差异，电泳后，根据片段与量的差异找到甲基化位点与甲基化程度，
（2）另一类是利用将没有甲基化的C变为其它碱基或其它物质，而甲基化的C不会发生相应变化来识别甲基化位点。甲基化特异的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是较常用的方法。
（3）一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测，Pyrosequencing技术是近年一种全新的技术，这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测，以及细菌和病毒的鉴定和分型研究。这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据，通过峰值的高度可以**的检测混合DNA模板中等位基因的频率，这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织，并且具有较高的重复性和**性。
MSP 实验流程：
1. 基因组抽提；
2. 基因组DNA定量；
3. 重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以，需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率；
4. 引物设计（每个基因设计两对引物，分别为：甲基化引物M，非基因化引物U，对应扩增甲基化和非甲基化的目的片段），有时需设计巢式引物；
5. PCR 扩增：对甲基化和非甲基化的目的片段分别扩增,此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度；
6. PCR 产物电泳；
7. 电泳结果分析（定性即有无甲基化，半定量即甲基化程度高低）。
BSP （亚硫酸盐测序法）实验流程：
1. 基因组抽提；
2. 基因组DNA定量；
3. 重亚硫酸盐转化（C转化为U)，本步实验至关重要，转化效率高低直接影响实验结果，所以，需要实验者在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率；
4. 引物设计（每个基因设计一对引物，引物位置尽可能的避开DNA中的CG位点），有时需设计巢式引物；
5. PCR 扩增：对实验样本进行PCR扩增，此时尽可能使用梯度PCR仪，可以同时使用不同的退火温度，以筛选合适的退火温度。
6. PCR 产物电泳；
7. 对目的条带进行切胶回收；
8. 回收后的PCR产物连接克隆载体（T载体）；
9. 转化E.coli H5α；
10. 挑选阳性克隆测序；
11. 测序结果分析：实验专业甲基化分析软件对测序序列进行甲基化分析，可以得到如下数据：
A. 测序序列与目的序列的相似度（%）；
B. C-T 转化效率（%）；
C. 目的片段中每个CG的甲基化情况（点状图）；
D. 每个CG的甲基化率(%)；

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