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流式分选实验|实验技术服务

关键词:流式分选实验|实验技术服务
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流式分选实验|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
1 作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有3方面：① 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2 注意事项：
① 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④ 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3 方法学程序
（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；
（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；
（3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；
（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1 剪碎法：
① 将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
② 用剪刀将组织剪至匀浆状；
③ 加入10ml生理盐水；
④ 用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
⑤ 离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片；
⑥ 以300目尼龙网滤去细胞团块；
⑦ 细胞用固定液固定或低温保存备用。
2 网搓法
① 将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
② 把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
③ 收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟；
④ 固定细胞或低温保存备用。
3 研磨法
准备一只70ml研磨器。
① 先将组织剪成1-2mm3大小组织块；
② 放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水；
③ 转动研棒，研至匀浆；
④ 加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
⑤ 收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀；
⑥ 固定或低温保存细胞悬液，备用。

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