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慢病毒载体构建，包装，纯化技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构和特性：整合入宿主细胞基因组，长期表达，可用于转基因动物制备；但也有不同于逆转录病毒的组份和特性：比逆转录病毒具有更高的滴度，不仅可以感染分裂期细胞，更重要的，还能感染非分裂期的细胞。利用慢病毒载体，可以研究启动子的调控、过表达特定基因或沉默特定基因。
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
(二) 实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
慢病毒载体构建包装实验流程如下：
1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；
2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；
4. 浓缩、纯化病毒液；
5. 用高质量的病毒液感染细胞；
6. 通过定量PCR**测定病毒滴度（高**滴定方法）和Western 分析实验结果；
7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。

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