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内皮细胞培养技术服务|实验技术服务

关键词:内皮细胞培养技术服务|实验技术服务
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内皮细胞培养技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
1.干粉培养基原倍液的配制
1）配制过滤除菌的细胞培养基
①阅读培养基使用说明，确定需要添加何种添加剂（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等）。
②根据所需将培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）将袋内残留培养基洗下整理并入容器。加注射用水至总体积的95%，轻微搅拌溶解。
③加入规定量的碳酸氢钠及所要添加的物质。
④轻微搅拌溶解，加注射用水至规定体积。
⑤用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至所需值。
⑥用0.22μm滤膜正压过滤除菌。
⑦溶液应在2℃～8℃下避光保存。
2.配制可高压灭菌细胞培养基
①根据所需将培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至总体积的95%，轻微搅拌溶解。
②在121℃、15psi下灭菌15分钟。
③待溶液冷却至室温，加入无菌0.2mol/LL-谷氨酰胺溶液规定体积、无菌7.5%（w/v）碳酸氢钠溶液规定体积，加注射用水（20℃～30℃）至规定体积，混匀。
④如果必要，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至所需值。
⑤溶液应在2℃～8℃下避光保存。
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮****、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法*为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。
5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。
肿瘤条件培养基制备：
1．取C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织。
2．胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培养液15ml（含10％小牛血清），接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养。
3．在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10％小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获得多量条件培养基。
4．4000转/分离心后，再通过0.22μm微孔滤膜滤过，－20℃冻存备用（临用前融解）。
初代培养：
1．取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks液洗除血污。
2．剥除被膜，分离出皮质，切成1立方毫米小块，加0.5％胶原酶室温中消化1小时，每隔10分钟用吸管吹打悬液令消化充分。
3．通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110微米长的毛细血管小段。
4．650rpm，4℃，离心7分钟后，弃掉上清胶原酶。
5．沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次。
6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培养液重悬后，稍吹打。
7．接种于铺有明胶底层的培养皿中，37℃培养，在培养头1～3小时中，毛细血管小段和内皮细胞*先帖附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮。
8．趁此时，吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液，每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1～4个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2～5天。
毛细血管内皮细胞分离培养：
1．初代培养2～3天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起。
2．镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除。此操作用细胞解剖器或用手操作均可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长（15～20分钟），圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除。
3．用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞。
4．剩余内皮细胞岛如小（5～20个细胞）而少时，生长增值变得缓慢或不完全不生长，此时需加入3T3等饲细胞，饲细胞接种量为4000细胞/cm2。
5．当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基。
6．接种入明胶底物皿中继续培养（饲细胞死亡淘汰），细胞增殖生长汇合后，按1：5传代。

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