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微生物菌群多样性分析(DGGE)|实验技术服务

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测序实验流程：
DGGE是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的*低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。
主要步骤
DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤:核酸提取，16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。有些学者通过克隆、测序建立微生物区系的16SrRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息，但这种方法相对于指纹图谱技术来说，费时费力，价格也相对昂贵。
核酸提取
微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础,是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细胞裂解有三种:机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等;化学法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合,发现组合后提取总DNA 的效果较好。Stahl等(1988)在含有SDS和酚的体系中加入适量的玻璃微珠DNA螺旋
DNA螺旋,机械法裂解瘤胃样品中的菌体细胞。
16SrRNA基因序列的PCR扩增
细菌的核糖体RNA按沉降系数分为5S、16S和23S三种,16SrRNA基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。16SrRNA基因序列全长1540bp ,有保守区和可变区之分,每种细菌的保守区都是相同的,能反映生物种类的亲缘关系,为系统发育重建提供线索;可变区因细菌种类而异,通过保守区设计引物,扩增出可变区,就可以得知微生物多样性信息。
DGGE指纹图谱分析
DGGE电泳图谱的分析*常用的是相似性聚类分析法。DGGE 胶通过扫描仪输入计算机,通过Molecular Analysis软件进行相似性分析。通过DGGE后得到的指纹图谱,每一条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和序列比对,可以得出此优势菌群的种类。

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