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细胞转染服务|实验技术服务

关键词:细胞转染服务|实验技术服务
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测序实验流程：
一、细胞传代
1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次
3. 用tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。
5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，**天转染。
二、细胞转染
1. 转染试剂的准备
① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
② 震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡。
2. 选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
三、**次细胞传代
1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。
3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、**天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

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