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荧光原位杂交FISH技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
实验方法及步骤
1. 探针变性
将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性
（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥
3. 杂交
将已变性或预退火的DNA探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交（约15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）
（1）在玻片的杂交部位加150 μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2）去掉保鲜膜，再加150 μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40 min。
（3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。
（4）在玻片标本的杂交部位加150 μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。
（5）去掉保鲜膜，加150 μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。
（6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。
（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
6. 封片
可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
7. 荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

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