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原核表达技术服务|实验技术服务

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原核表达技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
实验方案
1. 外源基因的诱导表达
（1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
（2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
（3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。
（4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5 h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5 h 。
(5 ）取上述培养液1 ml，1 000 g 离心，1 min，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
（1 ）细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
a. 酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
主要步骤为：
① 4 ℃ ，5 000 rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 ml ）。弃上清，约每克湿菌加3 ml 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
② 每克菌加8 μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。
③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。
b. 超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。
① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5 000 rpm 离心，15 min ；弃上清，约每克湿菌加3 mlTE 缓冲液。
② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000 g 离心，15 min ，分别收集上清液和沉淀。
③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS -PAGE 。
注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。

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