如何选择高内涵分析仪器

高内涵分析(High Content Analysis，简称HCA)是对高分辨率显微镜所拍摄细胞图像的自动提取和分析。市场上有三个类型的这种仪器：宽场荧光显微镜型高内涵、共聚焦荧光显微镜型高内涵和激光扫描型高内涵。研究人员应当如何选择呢?本文就给出大家一些建议以供参考。

高内涵分析是对高分辨率显微镜所拍摄细胞图像的自动提取和分析。高内涵，意味着丰富的信息。这些信息包括：单个细胞图像和各项指标，细胞群体的统计分析结果，细胞数量和形态的改变，亚细胞结构的变化，荧光信号随时间的变化，荧光信号空间分布的改变等等。人们往往因为特定的问题去设计实验，在图像中找到答案的同时，其他的信息会带来意外的新发现。

论文中单幅荧光显微图像通常显示的是阳性目标的有或无，强或弱，是定性分析。而高内涵技术的研究对象不是一个或少数细胞，而是对大量细胞的同时观察和分析，从大量图像中得到细胞群体的定量统计结果，结论更有科学说服力。因为分析的对象是完整的细胞，在一个实验中可以同时使用多种荧光探针，大量细胞的多参数同时分析有助于更深入地理解复杂的细胞学机理和相互作用。

此外，高内涵技术还有助于人为偏差的消除。人们往往会选择比较好的细胞来拍摄和分析，而机器是客观的，所有样品的成像分析条件是完全相同的。高内涵分析可在培养细胞、组织切片甚至3D培养上开展。它有着广泛的应用，如**筛选、多参数功能研究、化学基因组学、靶标验证和毒性检测等。

高内涵技术实现了高速显微成像，以前耗时费力的工作瞬间完成，研究人员可综合海量信息更快做出决策。在**靶标的确认、化合物的药理和毒性筛选上，高内涵分析优势明显，而对于复杂细胞学机理的研究，HCA所提供的有价值的信息可以帮助研究人员在日益激烈的科研竞赛中胜出。

经过这些年的发展，市场上出现了很多高内涵仪器(如下表)，这些仪器可以分为三大类：宽场荧光显微镜型高内涵、共聚焦荧光显微镜型高内涵和激光扫描型高内涵。

表1. 各种类型的高内涵仪器举例

激光扫描型高内涵是以激光作为荧光光源，用PMT采集光信号，通过预设间距点扫描获得数据，没有成像的过程，速度快是其大的优势。但这类仪器的局限性是分辨率不高，只能提供虚拟图像。X轴的分辨率是以预设的间隔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um)设定的，而Y轴是用户自行设定的，一般在1到10 um。由于不是基于图像的分析，分析软件相对简单，适合于比较成熟简单的细胞学实验。所以被很多**研发企业作为初筛平台。

而基础研究的实验设计相对复杂，很多时候需要在亚细胞水平对细胞内的微细结构清晰成像，检测的指标也复杂多样，需要非常强大的图像分析软件来设定，所以显微镜型的高内涵更适合科学研究的需要，**研发机构在复杂的筛选实验也会考虑使用显微镜型高内涵仪器。

在选择高内涵仪器时主要考虑三个方面：成像速度、成像质量和图像分析软件功能是否强大。

1.成像速度

高内涵仪器是在显微镜的基础上搭建的高速显微成像的平台，从所得图像中抽出一张和普通显微镜拍摄的图像没有区别，也就是说，宽场荧光显微镜型高内涵提供的是宽场荧光显微图像，而共聚焦荧光显微镜型高内涵提供的是共聚焦质量的图像。

高内涵仪器和普通显微镜本质的区别在于成像速度极大提高。如果每个孔取一个视野，双色荧光，Hoechst染细胞核，EGFP标记细胞器，硬件自动聚焦，GE Healthcare的IN Cell 2000可以在约3分钟内对整块96孔板成像，在短短几分钟内得到将近200张照片。IN Cell 2000能够高速成像是因为：1)明亮的光源，和显微镜以液体光导纤维相连，光的传输效率高，显著缩短曝光时间;2)大芯片CCD相机可选择，成像视野约是标准芯片相机成像视野的四倍，大芯片CCD相机一个视野就有可能捕捉到足够的细胞用于统计学分析，节省很多时间;3)在线细胞计数功能：微孔板各个孔中细胞的生长状态可能会不同，在线细胞计数针对不同的孔自动调整拍摄视野数量，整体缩短实验时间;4)自动聚焦：是提高成像速度的关键，IN Cell 2000提供基于激光的硬件自动聚焦和基于图像对比度的软件自动聚焦，二者可结合使用。

虽然宽场荧光显微镜型高内涵比普通宽场荧光显微镜成像速度快，共聚焦型高内涵比共聚焦显微镜成像速度快，但共聚焦型高内涵未必比普通宽场荧光显微镜成像速度快，所以用户须根据实验的需要来选择适合自己的高内涵仪器。IN Cell 2000虽然不是共聚焦高内涵，但其独有的去卷积图像复原功能可以显著提高图像的对比度和分辨率，提供可与共聚焦图像媲美的高��量的图像。

2、图像质量和成像速度之间的平衡

科研用户既希望成像速度快，又希望图像质量好，可以考虑GE Healthcare的IN Cell 6000。它是以激光为光源的可变光阑线扫描共聚焦高内涵仪器，拥有**的光学系统，成像完全可调：光阑完全打开时成像速度快，完全共聚焦模式去除背景有效，光阑打开的程度在1-3 AU之间可调，可以针对不同的需求调节共聚焦程度，达到成像速度和图像质量的优化组合。IN Cell 6000感光成像采用550万像素新一代sCMOS相机，噪音比CCD相机低五倍，超高灵敏度并缩短曝光时间，比标准相机的视野大四倍。

3、图像分析软件

科研用户检测的指标复杂多样，除了基本的模块式分析工具，还需要有更强大的分析软件允许用户自主定义分析程序。GE Healthcare的高内涵平台除了基本的分析工具，还提供IN Cell Developer Toolbox 客户自定义分析软件，可以分析各种实验的图像结果。针对特定的实验，用户使用一系列的图像分析工具来编写自己的分析程序，包括：**区分(segmentation)工具，图像处理工具，自定义测量值，宏子程序等。Developer Toolbox曾获得2006年全球佳生物图像分析软件奖(美国知名科学杂志《Scientific Computing》颁发)。

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