液质数据中，不但含有蛋白药序列表达是否正确的肽图信息，其它杂质蛋白同样可以被挖掘出来。然而，单纯的杂质蛋白鉴定却又是不够远远的，其确切的含量信息同样至关重要。沃特世PLGS软件可以在肽图液质数据中，进一步鉴定其中的杂质蛋白，并其相对含量信息进行分析。
一、“顺便”完成的杂质蛋白鉴定与相对定量
使用相应的开放数据库，PLGS软件首先根据液质数据中的离子碎片信息对多肽进行鉴定，进而组装出样品中的所有蛋白，完成蛋白鉴定步骤。在蛋白相对含量测定中，PLGS软件充分利用了MSE全信息串联质谱方法的数据优点。较DDA方法，MSE数据的离子色谱峰近乎“**”，更加符合实际多肽色谱峰型。通过**研究发现，MSE数据中的多肽色谱峰强度信息，与蛋白浓度相关性非常好。使用每个蛋白鉴定多肽中，强度前三的多肽峰强度加和值，即表征其蛋白浓度。因此，使用PLGS分析同一个肽图液质数据，便可“顺便”完成杂质蛋白的鉴定与相对定量工作。
二、蛋白**含量测定
如果想得到样品中准确的蛋白**浓度信息，也非常简单。只需在样品中加入一个已知的蛋白内标便可。这时Hi3分析方**根据内标蛋白的浓度，按照以下公式，对样品中的**浓度进行定量[1,2]。
三、使用Hi3方法分析残留宿主细胞蛋白(HCP)
融合抗体anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用仓鼠卵巢细胞系DG-44 CHO在两种培养条件下表达，表达后的PTG1 mAb再分别使用A、B两种方法纯化。经过2D-UPLC MSE方法采集液质数据后，使用PLGS软件分析[3]。在分析结果中，可以明确地给出鉴定到样品中含有的杂质蛋白，以及给出这些杂质蛋白的相对含量结果(图1)。为了验证Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法对以上实验结果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三个蛋白进行了定量验证。通过Hi3与MRM两种定量方法结果对比，可以发现两者定量浓度非常接近(图2)。在使用PLGS进行样品中的杂质蛋白鉴定与定量分析中，检索方法设置与肽图分析几乎一致，只增加将参考蛋白的名称与浓度列入分析参数一步。之后，所有的分析过程都将由PLGS自行完成，并直接给出蛋白鉴定身份与浓度的结果列表。实际上PLGS不仅使用在生物药杂质蛋白分析中，在样品极为复杂的蛋白质组学研究中，Hi3
方法已经被长期使用，并有众多高水平论文发表[4,5,6]。
图1. 杂质蛋白鉴定结果及其含量
图2. Hi3与MRM定量结果比对
参考文献
(1) Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP, Geromanos SJ.Absolute quantification of Proteins by LCMS. Mol Cell Proteomics.2006, 5, 144-156
(2) Silva JC, Denny R, Dorsc hel C, Gorenstein MV, Li GZ,Richardson K, Wall D, Geromanos SJ. Simultaneous Qualitative and Quantitative Analysis of the Esc heric hia coli Proteome. Mol Cell Proteomics. 2006, 5, 589-607.
(3) Catalin Doneanu, Keit h Fadgen, St Jo hn Skilton, Mart ha Sta pel s, Weibin C hen. A generic 2D-UP LC/MS assay for the identification and quantification of host cell proteins in biopharmaceuticals. Waters application note 2011, 720004043en
(4) Tenzer S, Wee E, Burgevin A, Stewart-Jones G, Friis L, Lamberth K, Chang CH, Harndahl M, Weimershaus M, Gerstoft J, Akkad N, Klenerman P, Fugger L, Jones EY, McMichael AJ, Buus S, Schild H, van Endert P, Iversen AK. Antigen processing influences HIV-specific cytotoxic T lymphocyte immunodominance. Nat Immunol. 2009, 10,636-646
(5) Stapels M, Piper C, Yang T, Li M, Stowell C, Xiong ZG, Saugstad J, Simon RP, Geromanos S, Langridge J, Lan JQ, Zhou A. Polycomb
group proteins as epigenetic mediators of neuroprotection in ischemic tolerance. Sci Signal. 2010, 3, 111, ra15
(6) Wang X, Kota U, He K, Blackburn K, Li J, Goshe MB, Huber SC, Clouse SD. Sequential transphosphorylation of the BRI1/BAK1 receptor
kinase complex impacts early events in brassinosteroid signaling. Dev Cell. 2008, 15, 220-35.
