成功转染**步:细胞培养注意事项
细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要,有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞,通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法;而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素,姑且不论。不过因为受限于特定的细胞,如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法,照做可也。如果是个新来的细胞株,好查查资料看哪些成功转染案例。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,看看其中是否有你的新对手——这个FuGENE 6 比较有优势,已有750多种细胞系成功转染的资料可供参考。聚焦转染专辑里面也一一列出查阅各主流转染试剂相关数据的网址。当然这只是参考而已,细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢?
一、健康而茁壮成长的细胞
转染前细胞好经过1—2次传代,以保证细胞生长旺盛,容易转染。注意,贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代,千万不要使细胞保持融合超过24小时,因为一旦长满了,细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体,细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化,这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化,融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率(融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率)。因此,如果观察到转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复佳结果。
二、恰到好处的铺板密度
转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂,要求转染时的适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低,乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数,有的要求细胞90%汇片;而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间,总之是尽量在细胞适的生理状态下转染,以求佳的转染效果。
不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度,比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因,就需要较低的铺板密度,所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。需要特别注意。
三、温暖舒适的培养基
健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性,需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。如果是培养新手,可留意随后的生物通细胞培养专辑,我们就不罗嗦了。还是专心介绍几种添加剂在转染过程中“影响因子”吧。
血清
血清一度曾被认为会降低转染效率,老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染,对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天,对于主流的转染试剂来说,血清的存在已经不会影响转染效率,甚至还有助于提高转染效率,比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说,血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成,但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA 和转染试剂就可以了,在转染过程中是可以使用血清的。这些方便好用、可在有血清条件下转染的试剂包括前面介绍的 Lipofectamine2000,FuGENE 6,GeneJuice,Effectene,Polyfect等等(看看生物通前面的介绍吧)。厉害的是Qiagen的2个产品,Polyfect和 Effectene,全程都可以用有血清和***等添加剂的完全培养基来操作,包括稀释步骤,不用担心培养基的变化对细胞生长有什么**影响了。这样,就不再需要在转染前多次洗细胞,也就减少操作的复杂程度,更重要的是不必再让细胞处于无血清的“悲惨环境”中转染,不必担心对血清缺乏很敏感的细胞受到不必要的麻烦了。娇贵的细胞们,你们有福了。不过要特别注意:对于RNA转染,如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
***
支原体、**、**污染,无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”,可能会严重影响转染结果,细胞培养过程中往往会添加***来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物。这些***一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使***可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡,造成转染效率低。所以,对于选择Lipofectamine2000系列转染试剂的实验,要特别注意在转染培养基中不能使用***,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用***。这样,在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些***是GENETICIN选择性***的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的***量。这里又要表扬 Qiagen的2个产品,Polyfect和Effectene,因为全程都可以用有血清和***等添加剂的完全培养基来操作,很方便的。对于筛选稳定表达株,要预留足够的时间让抗性基因表达后再添加筛选压力。
其他添加物如***,EDTA,柠檬酸盐,磷酸盐,RPMI,硫酸软骨素,透明质酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖这些物质的存在可能会干扰DNA和转染试剂形成复合物的过程,要尽量避免。
成功转染**步:质粒DNA转染
一、质粒的构建:启动子的选择
启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响,但是对转染结果却有着微妙的影响。
启动子可分为2大类:诱导型启动子是比较精明的,平时歇着,一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。而组成型启动子比较老实的,就是从头到尾不停干活从不闲着的那种——比如我们很熟悉的CMV启动子啊,SV40啊,pMC1啊,PGK启动子啊等等。
获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。在BHK-21中,CMV启动子活性比其他启动子如SV40和RSV都要高。但这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系,如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA- L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子,而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞)中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)时会提高,因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的,但是对于转染本身来说却不一定好——因为任何持续过高表达外源基因都可能带来某种程度的细胞毒性,影响细胞生长——如果外源基因本身对细胞生��有毒,那更完蛋了,你很可能筛不到转染成功的细胞株,更别提稳定转染了——因为过量表达本身可能已经害死了那个转染了的细胞,没转染的细胞又死于筛选压力。这种时候一个不那么“能干”的启动子可能更适合一些。如果你曾经遇到原因不明的转染失败案例,会不会是这个原因呢?过犹不及就是这个道理咯。
诱导型启动子对于转染来说,特别是稳定转染,可能是更好的选择。它使得目的基因的表达可以受到我们的调控——转染的时候不表达,筛选稳定表达株后再诱导表达,使得表达有毒性的基因或者**分析表达产物的生物学效应成为可能。多数诱导型启动子在接受某种信号后“打开开关”开始工作,也有的相反,在缺失某种信号后打开开关。Clontech还有个诱导系统是“剂量依赖的”,就是说不单表达开关可控,表达量多少也可以通过诱导剂的量来调控。还有一种特殊的启动子很好玩——具有时序性或者组织特异性(空间特异性),会受到特定的元件调控,在一定的时间或者特定组织细胞中表达的,比如那个转基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺细胞中表达的启动子——有人说这是组成型的,我觉得应该是诱导型的,只不过诱导的因素我们不知道罢了,这类启动子在不同的细胞中会有不同的表现,需要注意。诱导系统的问题主要是本底表达,表达量有限,以及诱导剂本身对细胞的影响和如何**,不过这些都不关转染的事,我们等生物通的表达专辑时再慢慢说吧。
转染DNA的启动子-增强子如果不被宿主细胞识别也会产生无法表达的“悲剧”,这是实验设计时需要注意的问题。不过现在利用现成试剂盒或者模拟国外已经成功的实验的居多,独立构建表达系统的极少,因而这种问题遇到的几率也几乎可以忽略不计。
目的基因:这个对于研究人员来说是目的,因而没有选择的余地。如果你的目的基因正好会影响选定细胞株的生长,甚至有毒,那好选择一个诱导型的启动子,不然你可能总是转染不了。但是通常在实验之前我们不清楚我们研究的基因产物是否对选定的细胞有毒,所以正负对照很重要。当排除其他原因后转染总是失败,应当从根本上考虑原因。
二、质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果:超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多,特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟,相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大,又没有经验,选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分,使得DNA形成转染复合物时更致密一些,更容易转染一些。
纯化质粒的质量无疑会影响转染效率。哺乳动物细胞总归是比大肠杆菌娇气,转染难度高些,因而要求的DNA纯度要更高些。早年要做转染真是大阵仗啊,光是提质粒做超离就令人皱眉。令人头疼的是内**了。内**是革兰氏阴性菌细胞壁上特有的成分,主要是脂多糖中的类脂A(lipopolysaccharides),在**被裂解时被释放出来,由于其化学结构和特性,在质粒提取的过程中内**很容易混入质粒DNA**同纯化出来。内**的存在会严重地影响转染效率,此外内**可能会激活造血细胞(例如B细胞、巨嗜细胞等)的非特异**反应,造成实验中的假阳性。所以质粒DNA转染时应尽量采用无内**污染的超纯质粒。幸好技术的进步令复杂的操作成为过去,多数实验室会选择使用转染级别的质粒纯化试剂盒纯化的质粒来转染。对于一些“耐受性高、容易操作的”细胞株,普通的Kit已经够了。对于一些对内**特别敏感的细胞,就要用“去内**”的质粒纯化Kit了。Qiagen的Endofree系列可以得到相当于2次CsCl超速离心纯度的质粒,同时特别设计去除内**,专为娇气的细胞系转染和体内DNA疫苗而设计。此外现在Invitrogen和Stratagene都有一些快速纯化质粒同时也去内**的Kit,使得去除质粒中的内**更为简便(参考生物通质粒纯化专辑)。
质粒DNA的浓度和量:既然质粒纯化已经不成问题,初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA,但是要注意的是,DNA量过少固然转染效率不高,DNA量过多同样会降低转染效率。有的初学者习惯按照说明书123地去操作而不求甚解,你“知其然”是否还“知其所以然”呢?DNA:转染试剂的比例的优化是非常重要的,特别是对于阳离子脂质体、多胺等带电荷的转染试剂来说,DNA-转染复合物所带的净电荷是由转染试剂和DNA的比例决定的,而转染复合物是否能更好地结合到带负电的细胞膜上,很大程度取决于这个净电荷。所以预实验需要按照说明书的要求,按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。有的转染试剂要求DNA的量多些,有的转染试剂效率高只要很少DNA,比如Effectene只需要常规五分之一的DNA。所以转染前好能**定量质粒。另外由于质粒本身的因素(比如目的基因产物是否有毒、启动子强弱等因素),单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响,所以同时做几组不同量的对照实验进行优化是很有帮助的。另外值得注意的是,当细胞铺板密度较高时,需要的质粒DNA和转染试剂的量也会略微提高。