PCR Master Mix的成分及使用简介

进行PCR试验时，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各种pcr反应所需的试剂，而在加入这些试剂时如果操作不规范很容易造成污染，导致PCR结果不准确，因此，为了简化反复添加各种试剂便将buffer、dNTP、DNA Polymerase等试剂先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即简化了PCR操作步骤，也减少了污染的途经。

一、产品简介：

2×PCR Master Mix中含有2×Taq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需加入适量引物、模板和水即可进行pcr扩增。大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。

利用2×PCR Master Mix可以进行各种常规的PCR扩增，特别适合用于定量和半定量的PCR扩增，以及2kb以下DNA片断的t载体克隆。

2×PCR Master Mix可以扩增出长达8kb的片断，但通常更适合用于扩增2kb以下的DNA片断。

本试剂盒用于50微升的PCR反应体系，足够用于160个反应，用于20微升的PCR反应体系，足够用于400个反应。

包装清单：

二、保存条件：

-20℃保存。

三、注意事项：

由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

Taq DNA polymerase在PCR过程中每循环的出错几率约为2.2x10-5，对于大于1kb的DNA片断的克隆推荐使用出错几率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检测，Taq DNA polymerase是佳选择。

为了您的**和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

四、使用说明：

1. PCR反应体系的设置：

a. 溶解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2XPCR Master Mix置于冰浴上或冰盒内。

b. 参考下表在冰浴上设置PCR反应：

对于不同类型的模板在50μl反应体积中推荐用量如下：

哺乳动物基因组DNA：0.1-1μg;大肠杆菌基因组DNA：10-100ng;质粒DNA：0.1-10ng。

过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物。

c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

d. 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油

(mineral oil，ST275)。

e. 各设置好的PCR反应管置于PCR仪上，开始PCR反应。

2. PCR反应参数的设置可以参考如下示例：

STEP1(起始变性): 94℃ 3min

STEP2(变性): 94℃ 30sec

STEP3(退火): 55℃ 30sec

STEP4(延伸): 72℃ 1min

STEP5(循环): Go To STEP2 for 30 cycles

STEP6(终延伸): 72℃ 10min

STEP6(临时保存): 4℃ forever

a. PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件

包括温度、时间和循环数等。

b. STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如

PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置

为2分钟，以此类推。

c. 对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进

行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。

五、常见问题：

1. PCR产物非常少或没有特异性条带。

a. 引物设计不佳是PCR过程中常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的

GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物

中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特

异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以

考虑更换引物。

b. 待扩增片断GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高

GC含量DNA片断的GC-rich buffer，并相应地根据GC-rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数

的设置。

c. 长片断扩增。尽���Taq DNA polymerase可以扩增长达8kb的DNA片断，但大多数时候比较适合扩

增3kb以下的片断，更长片断的扩增推荐使用其它更适合长片断扩增的DNA聚合酶。

d. PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。

e. 由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时

可以采用Touch down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55或50℃的方法，使退火

更加充分。

f. 退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的佳

温度。如果没有温度梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索佳的退火温度。

g. 延伸时间不足。可按照每1kb片断延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片断可以设置为每1kb片断

延伸1.5-2分钟。

h. 待扩增片断GC含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至95℃ 1min甚至95℃

2-4min。

i. 在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。

j. 循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。

k. 模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设

计的PCR引物内侧再设计一对PCR引物，然后对**次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这

样一方面可以起到扩增作用，同时也可以从**次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比

较简单地用原有引物对**次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不

能去除非特异性条带。

l. 模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。

m. 当产生较多非特异性条带时，可以适当提高退火温度。

n. 注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

PCR Master Mix现今已经广泛应用在各种PCR实验中，如Real Time PCR、多重PCR、巢式PCR等。使用PCR Master Mix即可以简化实验操作，又可以避免因多次对PCR管进行操作所造成的污染问题。