离心机分为二大类,即制备性和分析性离心机。
6.2.1 制备性离心机
制备性离心机又可分为三类:
1、普通离心机 大转速6000 rpm左右,大相对离心力近6000×g,容量为几十毫升至几升,分离形式是固液沉降分离,转子有角式和外摆式,其转速不能严格控制,通常不带冷冻系统,于室温下操作,用于收集易沉降的大颗粒物质,如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动,电机的碳刷易磨损,转速是用电压调压器调节,起动电流大,速度升降不均匀,一般转头是置于一个硬质钢轴上,因此**地平衡离心管及内容物就极为重要,否则会损坏离心机。
2、高速冷冻离心机 大转速为20000~25000rpm(r/min),大相对离心力为89000×g,大容量可达3升,分离形式也是固液沉降分离,转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统,以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量,离心室的温度可以调节和维持在0~40C,转速、温度和时间都可以严格准确地控制,并有指针或数字显示,通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和**沉淀物等的分离纯化工作,但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。
3、超速离心机 转速可达50000~80000 rpm,相对离心力大可达510000×g,有名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等,离心容量由几十毫升至2升,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离,离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现,使生物科学的研究领域有了新的扩展,它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离,还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
6.2.2 分析性超速离心
与制备性超速离心不同的是:分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程,见图34。
1.测定生物大分子的相对分子量 测定相对分子量主要有三种方法,沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用广的是沉降速度,超速离心在高速中进行,这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动,在**了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面,该界面随时间的移动而移动,这就是粒子沉降速度的一个指标,然后用照相记录,即可求出粒子的沉降系数。
S = (1/ω2X)·(dx/dt)
分子或粒子的相对分子量则可从Svedberg方程式来确定:
M = RTS/[D(1-υρ)]
式中M:该分子不含水的相对分子量;R:气体常数;T:**温度;S:分子的沉降系数;υ:分子的微分比容(当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积);ρ:溶剂的密度。
2.生物大分子的纯度估计 分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的常用方法之一,出现单一清晰的界面一般认为是均质的,如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。
3.分析生物大分子中的构象变化 分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化,例如DNA可能以单股或双股出现,其中每一股在本质上可能是线性的,也可能是环状的,如果遇到某种因素(温度或有机溶剂)DNA分子可能发生一些构象上的变化,这些变化也许可逆、也许不可逆,这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。
图:分析型超速离心机