内参就是内部参照,在生物基因表达检测中常常用到内参。内参主要用来做参照物校正上样量。生物试验中常用管家基因作为内参,因为管家基因在细胞内的组成相对比较稳定,表达也保持一致。常用的内参基因有GAPDH、18sRNA、β-Actin等,下文主要介绍β-Actin的主要特性。
Actin即“肌动蛋白”,是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守,以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括α-skeletal muscle actin,α-cardiac muscle actin,α-smooth muscle actin,和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中,包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%,但在N-terminal同源性仅50%-60%,因此N-terminal常被用作actin的抗原。
β-Actin
β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分,也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能,分布广泛。
β-Actin是PCR常用的内参,β-Actin抗体是western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为常见的三个动物细胞内参抗体。
β-Actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富。Beta-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。
β-actin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照,也常被用于**染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时,Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同,这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。
近些年来研究发现,将管家基因作为内参使用也具有一定的缺陷性,例如在不同类型的细胞、处于不同发育阶段的组织或者培养条件不同等情况下,这些管家基因的表达量往往会有较大差异,因此在选择内参基因时,要根据所研究的实验情况来选定表达比较稳定的管家基因作为内参。