不少生物过程都伴随着蛋白的磷酸化过程,而蛋白质磷酸化的平衡由蛋白激酶和磷酸酶的相互作用达到。因此,了解这些过程中的反应和调节成了不少科研工作者的重头工作,不过,罗氏推出的PhosSTOP或许能为您分担部分忧愁。
许多生物学过程和通路的调节都伴随着磷酸酯的形成和去除;而蛋白的磷酸化状态的平衡是由蛋白激酶和磷酸酶相互影响达到的。为了了解这些通道,大量的研究工作正在制药公司和研究院所开展。其中一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态,而这就需要对磷酸化状态的有效保护。
磷酸化的蛋白可以被非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶),特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或双重特异性磷酸酶去磷酸化。这里,我们就一种新的磷酸酶抑制剂混合片的性能做一介绍,称之为PhosSTOP。PhosSTOP是一种即用型的片剂,其中的一些磷酸酶抑制剂只需要纳摩尔级的量。无需花费漫长的时间寻找合适的磷酸酶,也不必繁琐的称量和混合。PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶,及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP1, PP2A, PP2B)和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。
一片PhosSTOP可以溶解在10ml的缓冲液中。PhosSTOP具有极好的溶解性,如果需要,可以将2-3片PhosSTOP也可溶解在同样体积的缓冲液中;相反,也可以选用小体积的缓冲液。溶解后的储存液体4℃可以稳定保存一个月以上,-20℃下可以保存6个月。
结果和讨论
磷酸酶无处不在;依赖于不同的物种、细胞或组织类型、实验中使用的特异的细胞状态,磷酸酶的种类和数量都会有差异。虽然每种磷酸酶都表现出不同的底物特异性,依赖不同的物种,几种分离磷酸酶用以测试抑制效果的范围。
PhosSTOP可应用于多种细胞提取物中磷酸酶的抑制作用,对酸性和碱性磷酸酶,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP1, PP2A, PP2B)和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用见表2。
磷酸酶活性的检测通过western blots实验检测,例如,丝氨酸磷酸酶特异性抗体(图2)。
PhosSTOP片剂可与含有福尔马林的缓冲液配合兼容使用;适用于福尔马林固定样本,保持组织切片中蛋白的磷酸化状态。
PhosSTOP片剂蛋白分离过程中有效保护蛋白,不会影响后继的蛋白检测(例如:western blot)或是蛋白浓度检测 (例如:BCA或是Bradford)。
结论和讨论
PhosSTOP可以方便的保护磷酸化蛋白免受去磷酸化作用;可持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶,及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP1, PP2A, PP2B),酪氨酸蛋白磷酸酶及双特异性磷酸酶在内的多种磷酸酶。
PhosSTOP可抑制多种来源的磷酸酶,包括动物,**,植物和酵母细胞;同时还可以与含有福尔马林的缓冲液兼容,适用福尔马林和石蜡固定的组织切片。
PhosSTOP与cOmplete 蛋白酶抑制剂兼容,实现对磷酸酶和蛋白酶的**抑制作用。
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您不再需要花费大量的时间寻找合适的磷酸酶,也不需繁琐的称量。PhosSTOP可同时持续抑制多种磷酸酶,且具有**的溶解性,并且溶解后的储存液体可在4℃条件下稳定保存一个月以上。