抗体的荧光标记法

发布时间：2017-06-20

许多蛋白质分子在其表面含有较多的赖氨酸残基。这些赖氨酸残基的游离ε - 氨基可与 FITC （其激发波长为 492nm, 发射光波长为 525nm ）共价结合。与 FITC 结合的抗体可用为特异性的探针，以测定细胞相应抗原的存在。 FITC 具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值 ,0 .85 ），而且形成的偶联物的稳定性很好。 FITC 是应用*广的染料，流式细胞仪就按 FITC 的特性，设计了激光波长为 488 nm, 很接近于 FITC 的*大激发波长 492nm ）。
偶联反应是在 pH 9.8 条件下，赖氨酸残基的游离ε - 氨基与 FITC 发生的亲核反应，由此形成硫脲连接。
操作步骤
１．用碳酸氢钠缓冲液 pH9.8 稀释抗体为 1-5mg/ml ，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；
２．将透析袋放入 100ml 含 0 .1 mg/ml FITC 的 pH9.8 碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光， 4 ℃搅拌过夜；
３．上述抗体液对 PBS 在 4 ℃透析以终止反应。其间至少更换 PBS 液三次，直致 480nm 的吸收为零；
４．加入 0.5g/L 的叠氮钠。此后，结合物在 4 ℃避光保存，或分装后在－ 2 ０℃冻存。
实验要点及说明
１．偶联反应要求在尽可能接近 pH9.8 的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此 pH 水平；
２．要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（ Tris, 氨及叠氮钠均可与 FITC 反应，因此会降低蛋白质与 FITC 的偶联率）；
３． FITC 与蛋白质的比值（ F/P ） , 可通过测定 495nm 与 280nm 吸光度来鉴定。此比值的范围应为０ .3 －１ .0 ；
４． FITC **的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；
５．如果 FITC －复合物对 PBS 透析不充分，可能造成高本底，对**染色产生干扰；
６．如果被标记的蛋白质是**抗体或通用的**抗体，则从商品购置可能更方便可取。

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