小鼠胚胎干细胞的培养
完全培养基: 高糖DMEM (GIBCO 12430); 15%胎牛血清(BIOCHROM S0615); 0.1 mmol/L非必需氨基酸(GIBCO 11140-050); 2 mmol/L谷氨酰胺(GIBCO 25030); 0.1 mmol/L β-巯基乙醇(GIBCO 21985); 1 000 U/ml白血病抑制因子(CHEMICON ESG1107)
冻存液: 90%胎牛血清或完全培养液; 10%二甲基亚砜(DMSO, Sigma D2650)
一 小鼠胚胎干细胞复苏
1. 操作前把培养液在37 ℃水浴中温热。
2. 从液氮中取出一支冻存管的小鼠胚胎干细胞, 放入37 ℃水浴中晃动, 直到只剩下小冰晶。
3. 吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量完全培养液的15 ml 离心管中, 1 000 r/min 离心5 min。
4. 吸弃上清液, 加4~6 ml 培养液, 吹打悬浮。
5. 重复吹打, 制成单细胞悬液, 尽量避免气泡。
6. 转移到1个已经铺好饲养层的25 cm2培养瓶中培养。
7. 每天换液。
要点: 复苏过程中“速融”是关键。由于在常温下DMSO 对细胞有毒性, 应尽量缩短复苏的时间。离心去掉DMSO。
