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1. 用TBS和PBS稀释的蛋白样品，好的稀释方法是由样品中的抗原稀释浓度决定的，但是由于抗原的浓度是未知的，所以有必要进行宽范围的稀释度的检测。SuperSignal West Pic化学发光底物的检测灵敏度可达皮g水平，所以样品的稀释范围可以从微克水平到皮克水平。如果要使用过多的抗原，结果会出现以下情况：非特异性条带、模糊条带和信号降低。
2. 斑点印迹——优化抗原和抗体浓度准备转印膜。所需膜的数量依赖于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少种不同稀释浓度。通常，一种或两种一抗的稀释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗。
3. 将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上（2-5 ul为宜），因为用的体积越大，信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30分钟或直至无可见的水分。
4. 用含0.05%的Tween-20封闭液封闭膜上的非特异性点，室温震荡孵育1 h。
5. 将一抗稀释到封闭液/Tween-20去污剂中，并加到膜上，室温震荡孵育1h。
6. 用TBS或PBS洗膜4-6次，用尽可能大体积的洗脱液，
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在洗脱液中加入0.05%的吐温，用以减少非特异背景。每次洗脱过程中，使膜悬浮在洗脱液中震荡大约5分钟，倒出洗脱液并重复。孵育前，在洗脱液中短时间的漂洗可能会增加洗脱效率。
7. 制备二抗/HRP结合的封闭试剂/Tween-20去垢剂稀释液，将二抗稀释液加到膜上震荡孵育1 h。
8. 斑点印迹——优化抗原和抗体浓度按第6步方法再次清洗膜。
9. 准备底物工作缓冲液，混合等体积的鲁米诺/增强剂和稳定的过氧化物溶液。制备足够体积确保印迹点完全湿润，保证印迹点在孵育过程中不会干。推荐体积：0.1 ml/cm2印迹面。
10. 将膜在超感应显色底物工作液中孵育5分钟；
11. 将膜从底物上移除，放到塑料布或其它防护膜上；
12. 将印迹贴到胶片上，在蛋白旁边曝光。任何标准的或者增强的放射自显影胶片都可以用。推荐**次曝光30-60 s，为得到*佳结果，曝光时间可不同。另外，也可用CCD相机或其它成像设施；然而这些设施可能需要更长的曝光时间。
13. 斑点印迹——优化抗原和抗体浓度在*佳的印迹膜上，超感应反应底物产生的信号可能会持续超过8 h。未获得*佳结果，印迹能重复曝光到胶片上或者成像系统中。随印迹时间的延长，需延长曝光时间。如果未得到*佳结果，可用抗原和/或抗体稀释液重复进行这个程序。
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