流式细胞仪是通过内置的激光器发射激光激发荧光染料，即被488nm或其它特定波长的光激发后，发射出另一特定波长的发射光，并通过光电倍增管或光电二极管将光信号放大转变为电信号或数字信号，并由计算机统计处理为可读数据。
用激光束激发两种或两种以上荧光染料而发出不同波长的荧光，从理论上讲，可以选择光学组件将它们分开，仅使一种荧光被一种荧光探测器收集处理，而检测不到另外一种荧光。但实际上由于荧光素的发射波长是正态或偏正态曲线，即有很宽的范围，荧光素之间的波谱常有重叠现象，如下图1-1所示。由此，我们需要进行补偿调节，补偿的强度将随着各荧光探测器的放大倍数（电压）的变化而变化，特定的电压对应特定的补偿参数。
图1-1 FITC和PE发射光谱
对于荧光补偿的确定，需运用以上补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。以FITC,PE双色分析为例：
（1）先调节阴性对照管：将原补偿清零，首先调节电压，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。
（2）FITC单染管：在理想情况下（没有荧光干扰），因检测管中不应该出现PE信号，但实际情况是在FITC与PE的双阳性区出现了荧光信号。这个信号就是PE探测器检测到的FITC信号。此时需要通过调节补偿参数，取合适的补偿强度来抵消PE中的信号。如下图所示，调节补偿（PE- %FITC ),使得两群细胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通过经验判断（原则为“横平，竖直”）。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，即PE信号与阴性对照一样时，PE对FITC的补偿调节完成。
（3）PE单染管：同理，将进入FITC探测器的PE信号通过补偿调节来消除。
（4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。
图1-2 FITC和PE通道补偿调节
图1-3 补偿不足和过补偿的双参数点图
补偿调节抗体的正确选择对于荧光通道之间的补偿调节是非常重要的。要求选择的抗体所结合的抗原分子在样本细胞中有明确表达，占样品细胞的10%以上，50%以下。如果阳性细胞比例太低，在阳性细胞区域无法形成明显的细胞团，无法判断调节是否合适。如阳性细胞比例过高，则不表达该抗原的阴性细胞无法形成明显的细胞团，如图1-4直方图所示。
图1-4直方图
