磷酸钙法转染HEK293T细胞实验方法
一.试剂配制
无菌水ddw: 高温**; 分装;
2XHBS: 280mM NaCl
10mM KCl
1.5 mM Na2HPO4
12 mM glucose
50 mM HEPES
Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤**,分装;
2M CaCl2: 过滤**,分装。
二. 实验过程:
1. 铺细胞: 选择状态良好的293t细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish。
2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染。下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:
ddw: 105ul
plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)
2M CaCl2: 16.5ul
2XHBS: 125ul
按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。
先将前三者混匀, *后加2XHBS。
一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。
另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。