Tris-HCl Buffer,2.0M,pH7.4实验原理:
RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA必须*大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度变性剂TRIzol,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶,Tris-HCl Buffer,2.0M,pH7.4所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后,除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片,通过氯仿、异丙醇等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
Tris-HCl Buffer,2.0M,pH7.4实验目的:
1.掌握真核生物细胞基因组RNA制备和定量的基本方法。
2.掌握反转录PCR的原理及实验方法。
3.掌握PCR技术原理和基本实验步骤。
实验仪器和材料:
低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱,水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、 氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC H 2 O)配制、DEPC H 2 O
Tris-HCl Buffer,2.0M,pH7.4实验步骤:
1. 取50-100mg(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml匀浆器中,加入1ml TRIzol充分匀浆,室温静置5min。
2. 加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
3. 4℃离心,12000g×15min,取上清置另一1.5ml离心管中。
4. 加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
5. 4℃离心,12000g×10min,弃上清。
6. 加入1ml75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃离心,7500g×5min,弃上清。
7. 晾干,加入适量的DEPC H 2 O溶解(65℃促溶10~15min)。
8. Tris-HCl Buffer,2.0M,pH7.4快速电泳检测RNA完整性。