宫颈采样拭子A

宫颈采样拭子A碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，宫颈采样拭子A保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

宫颈采样拭子A注意事项     

1.  当RNApure Reagent用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙烯材质试管。

2.  当RNApure Reagent用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙烯材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入RNApure Reagent和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。

3.  离心前小心平衡试管。

4.  离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。

5.  从少量的组织(1~10mg)或细胞(102~104)中分离RNA样品：调整样品体积到0.25ml，往组织或细胞中加入0.75ml RNApure Reagent。宫颈采样拭子A待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前，加入5~10μg无RNA酶的glycogen作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应**链的合成也不会抑制PCR。

6.  在匀浆化后和加入氯仿之前，样品可以在–60~–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA漂洗）放置于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周，在–5~–20°C下至少可保存一年。

7.  台式离心机宫颈采样拭子A*大能达到2,600×g的离心力的，如果将离心时间延长到30~60分钟可以满足步骤2和步骤3中的操作。