大肠杆菌TB1菌种RealTime PCR技术服务：
一、荧光定量PCR化学原理介绍
实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，*后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
二、大肠杆菌TB1菌种主要实验步骤
1、设计并合成Realtime PCR引物。
2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR® Green）的PCR反应的优化。
3、 样品RNA抽提 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4、RNA质量检测
a. 大肠杆菌TB1菌种紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度
b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5、使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
6、 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7、标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测。
8、 大肠杆菌TB1菌种检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9、提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。
三、大肠杆菌TB1菌种样本准备
组织或细胞标本
