汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
【包装规格】48 份/盒
【检测方法】RT-PCR 荧光探针法
【检验原理】
本试剂盒用特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)RNA 进行体外扩增检测,仅用于科研使用。
【试剂组成】
名 称
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规 格
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酶液
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50μl×1 管
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反应液
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1.0ml×1 管
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阳性质控品
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50μl ×1 管
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阴性质控品
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250μl ×1 管
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汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融少于 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJOpticon2 等其他荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
剖检猪取肠内容物和肠系膜**结;待检活猪,取排泄物,于离心管中。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
组织:分别从肠系膜**结的 3 个不同位置取样,称取样品约 1g,用手术剪剪碎混匀,再称取 0.05g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL **离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100uL 于 1.5mL **离心管中;排泄物:取 0.05g 于 1.5mL **离心管中,加入 1mL生理盐水涡旋振荡,8000rpm 离心 2min,取上清液 100uL 于 1.5mL **离心管中。
1.2RNA 提取
RNA 提取试剂盒(离心柱提取法),请按照试剂盒说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μl,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25ul;荧光通道选择:
检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3推荐循环参数设置:
步骤
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循环数
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温度
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时间
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收集荧光信号
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1
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1cycle
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42℃
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20min
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否
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2
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1 cycle
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95℃
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10min
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否
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3
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40 cycle
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94℃
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15sec
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否
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55℃
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30sec
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是
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5. 汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35.0<Ct 值≤37,建议重复检测,如果检测通道仍为 35.0<Ct值≤37,且曲线有明显的增长曲线,判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>37 或无 Ct 值。
6. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
Ø 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
7. 质控标准
阴性质控品:无明显扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32;
以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
8. 产品性能指标
阴阳性参考品符合率:5 份阳性参考品符合率为 100%;10 份阴性参考品符合率为 100%。
*低检测限:5.0×102copies/ml。
精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
汉坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)【注意事项】
Ø 所有操作严格按照说明书进行;
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
Ø 反应液应避光保存;
Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物**通则》进行处理。
鲤春病毒(SVCV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
鲤春病毒(SVCV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
狂犬病毒(RV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
狂犬病毒(RV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
山羊痘(GPV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
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伯氏疏螺旋体(BB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
蚕微粒子病(NB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
蚕微粒子病(NB)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
西尼罗河病毒(WNV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
猪托克特诺病毒(TTV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
猪脑心肌炎病毒(EMCV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
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猪流感病毒通用型(SIV-U) 核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
猪戊型肝炎病毒(HEV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。
猪戊型肝炎病毒(HEV)核酸检测试剂盒(RT-PCR法) 规格:48人份/盒 精密度:批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数(CV)均小于等于 3%。