第三代慢病毒包装质粒系统包括有：Gag基因作用是编码病毒粒子主要结构蛋白；Pol基因作用是编码特异性的逆转录酶；RRE基因作用是Rev蛋白的结合位点，有利于RNA的出核转运。pMDLG/pRRE质粒不含有Rev基因。第三代慢病毒包装质粒提供了*大的生物**性，但是由于需要同时转染四个不同的质粒到产毒细胞中，在操作上也更加复杂。 常用的第三代慢病毒包装质粒组合是: pMDLg/pRRE + pRSV-Rev + pMD2.G.
请注意，大部分的Trono实验室慢病毒载体含有一个野生型的5' LTR 。这种类型的慢病毒载体，只能够使用**代慢病毒包装质粒进行包装。这是由于野生型的5' LTR必须要有TAT序列，才能够被激活。
如果你想使用第三代慢病毒包装质粒，你的慢病毒目的基因质粒必须含有一个嵌合型的5' LTR片段（例如CCL-, RRL-等基因），在该片段中HIV启动子被CMV和RSV启动子取代了，所以该慢病毒质粒，并不依赖于TAT系统。
含有嵌合型5' LTR的慢病毒质粒，既能够使用**代慢病毒包装质粒，也能够使用第三代慢病毒包装载体。
