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**荧光（IF）常见问题及优化方案
日期：2024-06-18 21:35
浏览次数：274
摘要：
**荧光（IF）常见问题及优化方案
以下就是对于**荧光（IF）常见问题及优化方案详细解答：
问题
可能原因
优化方案
信号弱或无信号，
染色细胞过少
目标蛋白在细胞中没有表达
制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达
表达目标蛋白的细胞过少
标本中使用更多的细胞，...
**荧光（IF）常见问题及优化方案
以下就是对于**荧光（IF）常见问题及优化方案详细解答：
| 问题 | 可能原因 | 优化方案 |
|
信号弱或无信号， 染色细胞过少 |
目标蛋白在细胞中没有表达 | 制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达 |
| 表达目标蛋白的细胞过少 | 标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系 | |
| 细胞通透性差 | 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂 | |
| 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 | 改用其他固定方法 | |
| 通透使抗原丢失 | 减少通透剂作用的时间或强度 | |
| 抗体不识别 | 换用其他抗体 | |
| 一抗稀释度过大 | 同一样品按*佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定*佳的一抗稀释比例 | |
| 二抗选择错误 | 使用正确的二抗 | |
|
背景过高 |
一抗质量不高 | 使用特异性高，效价高的一抗 |
| 一抗浓度太高 | 同一样品按*佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定*佳的一抗稀释比例 | |
| 二抗浓度太高 | 同一样品按*佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定*佳的二抗稀释比例 | |
| 封闭不完全 | 使用二抗来源动物的非**血清进行封闭；改善封闭条件 | |
| 封闭液BSA中含IgG | 使用高纯度（IgG free）的BSA | |
| 洗涤不充分 | 充分洗涤 | |
|
细胞呈扁平状 |
细胞片被风干 | 在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 |
| 使用了甲醇固定 | 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂 | |
|
细胞有自发荧光 |
使用了戊二醛固定 | 在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
| 材料本身（如石蜡）有自发荧光 | ||
|
细胞模糊，封片剂明亮 |
因洗涤不充分导致背景太亮 | 充分洗涤 |
| 二抗结合太弱 | 确保抗体牢固结合，确保固定良好 | |
|
整个细胞片都出现荧光亮点 |
二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 |
| 二抗发生沉淀 | 过滤或离心荧光标记二抗 |
以上所提供的是一种简略的问题查找方案，更好的实验结果还是要同志们再次实验尝试的，其中实验试剂的品质也是非常重要的一个环节。老司机在此为您推荐一些用的上的好产品，助一臂之力！
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| Normal xxxx Serum | 更多封闭血清产品 | 咨询艾美捷科技 |
| IFKine Green Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24211 |
| IFKine Green Donkey Anti-Rabbit IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24221 |
| IFKine Green Donkey Anti-Goat IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24231 |
| IFKine Orange Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24311 |
| IFKine Red Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24411 |
| IFKine Red Donkey Anti-Rabbit IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24421 |
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|
高纯牛血清白蛋白（BSA）粉末
（IgG free） |
BSA中的封闭** | BAH67 |
