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RT-PCR
RT-PCR
反转录PCR(Reverse Transcription, RT-PCR)又称为逆转录PCR,是指扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA,然后再以cDNA为模板,用PCR方法加以扩增。
(一)逆转录酶的种类
(二)引物的选择
用来进行反转录的引物及其常用的推荐浓度如下表所示:
(表格引用Promega公司的 GoScript 反转录系统操作方法说明书)
(三)优化及注意事项
AMV:有较强的聚合酶活性和RNA酶H活性。*适42℃。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。
MMLV:有强的聚合酶活性,而RNA酶H活性较弱。较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。*适37℃。
Super RNaseH- Reverse Transcriptase:MMLV反转录酶的RNase H-突变体,它能将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的模板合成较长的cDNA,*适42℃。(商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ)
GoScript Reverse Transcriptase:专为 qPCR 而设计,利用 M-MLV 和先进的缓冲液技术获得均衡稳定和可靠的 cDNA 合成结果,适合各种大小范围的低丰度和高丰度的转录子,即使存在抑制剂也不受影响。
反转录引物有多种选择,Oligo(dT)、随机引物、基因特异性引物(GSP)等。
Oligo(dT)15
Random Primer
Oligo(dT)15+Random Primer
Gene-specific primer
1. 逆转录PCR时,提取RNA是关键,需分离高质量RNA(纯度和完整性)。
2. 整个操作过程需使用祛RNA酶耗枪头及EP管。
3. 反转录过程中要谨防RNA酶的污染,加入RNA酶抑制剂。
4. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
5. 使用无RNaseH活性的逆转录酶
6. 提高逆转录酶保温温度
7. 减少基因组DNA污染
8. 对于反转录酶活性来说,二价阳离子是必需的。 对于大多数反转录反应,建议加入氯化镁至镁离子终浓度为2.5 mM 以得到*佳结果,可在1.5到5mM范围内调整优化。对于长片段 RNA 的反转录,可以降低镁离子浓度以提高延伸的完整性;短片段RNA的反转录,可以提高镁离子浓度以提高反转录的效率。