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韩春雨详解新版实验方法要点称新旧实验方法无本质区别

日期：2024-11-23 23:53

浏览次数：162

摘要： 8月8日，河北科技大学副教授韩春雨向非营利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。此前，韩春雨领导的课题小组发明新的基因编辑技术NgAgo－gDNA，被国内媒体誉为做出“诺奖级”实验成果。然而，论文发表两个月后，全球仍没有一家实验室对外宣布能够完全成功重复韩春雨的实验，多国科学家要求发表韩春雨论文的《自然-生物技术》介入调查并公开实验中的所有原始数据和实验条件，该期刊表示将按照既定流程来调查此事。 10日，韩春雨**回应南方都市报，表示其他科学...

8月8日，河北科技大学副教授韩春雨向非营利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。

此前，韩春雨领导的课题小组发明新的基因编辑技术NgAgo－gDNA，被国内媒体誉为做出“诺奖级”实验成果。然而，论文发表两个月后，全球仍没有一家实验室对外宣布能够完全成功重复韩春雨的实验，多国科学家要求发表韩春雨论文的《自然-生物技术》介入调查并公开实验中的所有原始数据和实验条件，该期刊表示将按照既定流程来调查此事。

10日，韩春雨**回应南方都市报，表示其他科学家无法复制实验结果的原因，他也在研究，但目前不能随便下定论，必须有科学的结论才能发声。目前提交的新实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，其中*有价值的部分是提出了一些注意事项。

新版实验步骤有四处变化增加四个注意事项

5月2日，韩春雨课题组的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》在《自然-生物技术》网络版发表，随后引起了广泛关注。韩春雨小组得出的结果是以DNA来介导NgAgo（一种核酸内切酶）对靶向基因的识别从而进行基因编辑，被认为是基因编辑领域的一项重大突破。

韩春雨因此走红网络，被许多人视为在普通学校也能做出**科研成果、耐得住寂寞搞科研的典型样本。同时有观点认为，NgAgo将取代CRISPR成为新一代主流的基因编辑技术。不过，韩春雨本人对此相当谨慎。他曾在接受媒体采访时表示，NgAgo系统和CRISPR都为基因编辑应用提供了更好的工具和多样化的选择，各有各的用处。

然而，在论文发表后的两个多月后，没有一家科研团队宣布成功重复出韩春雨的实验结果，使得这项新基因编辑技术受到极大的质疑。

8月8日，河北科技大学副教授韩春雨向非盈利性质粒共享信息库Addgene网站提交新版的详细实验方法，南都记者看到，其中一些实验步骤与其在《自然-生命科学》中发表的论文有所不同。

据“科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科研圈”介绍，新版实验步骤有几处变化：

1.血清品牌由 Hyclone 变更为Gibco；

2.增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示；

3.建议在质粒/gDNA共转染的时间从“24小时”变成了8小时、12小时或24小时后；

4.溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液从含有 EDTA 的0.5xTE变更为水（pH 8.0）。

此外，实验步骤之后还有“在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底**”、“在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDT。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子”等四条注意事项。

有研究者认为，新版实验步骤第三条提到的补转gDNA和第四条中缓冲液的变化，尤为关键。

值得注意的是，实验步骤后补充的四条注意事项中， EDTA 再次被强调。据了解，EDTA是一种金属离子螯合剂，可以螯合镁离子，而根据韩春雨补充的说明，镁离子恰恰是 NgAgo 系统发挥作用的必要条件。有学者认为，此前多国学者无法重复实验结果，或许就是EDTA“神不知鬼不觉”地产生了影响。

新方法公布后争议仍未止息

此前，由于多国科学家无法重复出实验结果，有人质疑韩春雨在论文中隐瞒了实验的关键条件。 “《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，这是学术期刊的义务。”质疑者之一的布尔焦说。

新版方法刚刚公布，尚未有人公开声称调整后的方法有效。一位重复实验结果失败的国内研究者则对南都说，实验时确实没有注意到新版方法中涉及的细节，将在近期继续尝试。他对重复成功表示了审慎乐观。

但在NgAgo的谷歌讨论组内，争议仍未止息。名为Jonathan Geisinger的用户认为，新版实验方法并不具备足够的说服力。名为SL的用户则表示，问题的关键仍然在于韩春雨如何达到论文中21%-41%基因编辑效率，新步骤看起来不足以让那些重复实验失败的人将效率提高到20%以上。

《自然-生物技术》：暂未取得可公开的调查进展

8月8日，《自然-生物技术》发言人称，将按既定流程调查韩春雨的研究。“已有若干研究者联系本刊，表示无法重复这项研究，”发言人说，“《自然-生物技术》对于人们提出的任何关于论文的疑虑都会认真对待，并加以慎重考虑。”

发言人同时表示，作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一，作者须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供，不可加以不当限制。

有研究者认为，韩春雨新公布的实验方法发生了变化，但这并不意味着韩春雨违反《自然-生物技术》的要求，在此前的论文中隐瞒了实验的关键条件。

以新步骤中缓冲液的变化为例，这名研究者说，基因编辑的实验中，用水和含有EDTA的0.5xTE做缓冲液都很常见，大多取决于研究者的个人习惯，可能正因为此，韩春雨在此前的论文中没有特别强调避免EDTA的影响。

10日下午3时许，《自然》工作人员对南方都市报记者表示，目前韩教授没有将*新的实验方式提交给杂志社，因此不好发表评论。此外，对于期刊此前声明对韩春雨论文的调查，暂时没有可以对外公开的进展。

**对话韩春雨

10日，韩春雨**回应南方都市报，表示新提交的实验方法，当中*有价值的部分是提出了一些注意事项，如避免细胞的污染。韩春雨称，这些新的实验方法是在和其它科学家讨论之后得出的，此前自己只是从自己的经验、习惯出发去撰写实验方法，对别人可能遇到的问题考虑不周全。

韩春雨对南都记者表示，其他科学家无法重复的原因，他也在探究，但目前不能随便下定论，“重复性到底是由什么决定的，比如我们认为是细胞污染，那我们必须有科学的结论才行，要拿出证据，不能随口一说。”

韩春雨认为，这些研究工作并不是他一个人的责任，所有的科学家都可以做的，“这一个东西提出来之后，其实就是提供给全世界了，让全世界科学家一起去解决这里面的问题。”

对于是否有人已经复制成功，对实验结果是否仍然有信心，韩春雨表示，《自然》的*新报道是***的，除此之外均不作回应。

南都：*近你向质粒共享信息库 Addgene 提交了更详细的新版实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。为什么会作出这些改变？

韩春雨：**个关于血清的品牌的改进并不重要，只要保证是热灭活的血清就可以；**个补充DNA guide时间，这是要根据细胞的传代速度和蛋白表达时间来决定的。每个实验室里的细胞都不同，所以需要根据实验用细胞的蛋白表达时间去补加DNA guide，这个是需要摸索的。而以前的方法是根据我当时的实验确定的；第三个改进，将缓冲液从含有 EDTA的TE换成PH8的水，主要是因为NgAgo需要镁离子，我们要尽量去掉所有含有EDTA的试剂。

南都：此前为什么没有提出这些注意事项？

韩春雨：通过*近和其他一些研究者交流，我认为这些可能会被研究者忽视。

南都：*新提交的实验方法与原来的实验方法有什么不同？

韩春雨：原则上没有本质区别，但增加了需要特别注意的事项，例如避免使用污染的细胞；还有一些细节，例如如何磷酸化ssDNA，以及避免Mg离子损失。

南都：这次提交新的试验方法，*重要的价值在哪里？

韩春雨：新的实验方法当中*重要的部分是根据实验室经验提出了一些注意事项，排在前面的是*重要的。在我们注意事项中的**点，就是NgAgo系统对细胞的污染，包括支原体、寄生菌的污染极其敏感，避免使用污染的细胞。

南都：你认为是细胞的污染导致很多科学家无法复制你的实验吗？

韩春雨：其他科学家无法重复的原因，我们也在研究。但必须要作出科学的结论来才行，不能随口一说。比如用污染的细胞和不污染的细胞对比，以及这些污染到底是什么。

其实这个工作是所有科学家都可以做的。比如说他会去研究污染如何对NgAgo系统起作用，可以作为科研论文去发表。我们的经验分享给大家，别人有经验也可以去分享，这就是科学的态度。

南都：你是怎么得出这一新的实验方法的？

韩春雨：这是跟别人在讨论当中发现的，有一些我们也在优化。一个技术出来，它的优化是需要不断进行的，每次都可能有一些小的进步。比如在细胞培养液中添加镁离子效果更好。

南都：为什么选择Addgene这个平台，而不是原来发表期刊的《自然-生物技术》？