流式检测结果优化——抗体滴定

抗体滴定（antibody titration）就是确定*佳的抗体用量和抗体浓度，以实现阳性信号尽可能强，而阴性信号尽可能低即得到*优的S/N（信噪比值）。一般抗体供应商都会推荐抗体使用量， 如Test包装抗体。但为了达到*好实验效果及节省抗体，我们则需要自己做滴定，尤其在多指标流式检测实验中，抗体滴定就更加重要了。

图1 （图片来自流式中文网）

根据S/N值，可以得出0.1ug为*优用量

具体的抗体滴定步骤如下：

以APC-CD49b（BioLegend  Cat#108909）抗体为例，浓度为0.2mg/ml，推荐抗体使用浓度为 ≤0.25 μg/100ul 。起始滴定浓度一般为推荐浓度的两倍（即起始浓度为0.5ug/100ul），做8次2倍稀释。假设用100ul体积，在**孔/管的97.5ul稀释液里加入2.5ul抗体，然后从**孔/管取出50ul加入**孔/管的50ul稀释液中，从**孔/管中取出50ul加入至第三孔/管的50ul稀释液，依次倍比稀释，*后，向每个孔中加入50ul细胞，注意整个操作，抗体要充分混匀。

此外，您还需了解两个概念：抗体饱和浓度和*佳分离浓度，前者是指能够发出*大荧光强度的*低抗体浓度，后者是指能够使您的结果S/N值*优的抗体浓度。对于某些抗体而言，*佳分离浓度可能远低于饱和浓度。但正是因为*佳分离浓度小于饱和浓度，所以染色后的荧光强度是与时间、温度等等条件都相关的。一般建议在使用某种抗体前，都要进行滴定。滴定结果依赖于样本、染色步骤、流式仪器型号、滤光片配置等等条件。例如：在用固定/破膜法和表面标记法两种情况下，滴定结果是不同的；而在滴定人类细胞和猴细胞样本，结果也是不同的。

抗体滴定并不是以抗体量/细胞数来表示的，滴定的是抗体浓度（如ug/ml），其与细胞量在标记10万和1000万个细胞范围内相关性不大。如果您准备用于标记1亿个细胞，千万不要将抗体用量也增加100倍。通常只需增加2－5倍即可，有时甚至不用增加用量。如果您经常标记1亿个细胞（如分选细胞时），做2－3个点的快速滴定是很有用的。同样的道理，如果您只标记5万个细胞，那么也千万不要减少抗体用量。记住，与抗体用量相关的指标是浓度（抗体量/染色体积）。这意味着，如果您是100ul的体积下进行滴定抗体，而染色时使用1ml的体积，那么你就需要用10倍的抗体量。同样的道理，如果您在200ul体积下进行滴定，而染色时使用50ul体积，那么您就需要用1/4的抗体量。

染色之后，一般确定SI（染色指数）或S/N（信噪比）*高的浓度，但有时也需要考虑一下抗体用量。