几种线粒体的提取方法，你知道几个？

几种线粒体的提取方法，你知道几个？

提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案：

心肌组织切碎后在4 ℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，0-4℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆经750g、离心10 min后留上清，以9000 g离心20 min 后留沉淀，重新悬浮后以9000 g再离心20 min，弃上清得线粒体.全部操作于4 ℃进行。

培养细胞提取线粒体.细胞弃去培养液后，用细胞收集液作用2到3 min，用scraper,将细胞收集起来，6000 g离心15 min。弃上清，之后加细胞匀浆液，用匀浆器或手动匀浆管匀浆，将装有匀浆液的离心管配平后放入普通离心机，以2500 rpm，离心15 min,缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中.以17000 rpm离心20 min，弃上清，留取沉淀物。加入0．25mol/L蔗糖与0．003 mol/L氯化钙液l ml，用吸管吹打成悬液，以17000 rpm离心20 min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液.即得线粒体。

简单的鉴定人线粒体的方法:

1、形态法辨别

取你用试剂盒提取*后一步的上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上,标记涂片，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

2、PCR法

抽提你提取的线粒体DNA。人线粒体基因由16569个碱基对组成。基因组含有37个基因，其中13个为蛋白质基因。2个为rRNA基因，还有22个tNRA基因。可以选择扩增其中编码电子传递链酶复合体中的亚基基因进行辨别。

3、利用单抗进行标记检测

线粒体外膜的标记酶为单胺氧化酶,用单胺氧化酶单克隆抗体进行反应后上流式细胞仪进行检测。

4、电镜下观察（有条件的话上电镜进行观察恐怕是*直接的了）

线粒体提取试剂盒的操作步骤：

1. 样本处理 a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次； b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800g离心5~10 min收集细胞，计数。每次提取需要5×107个细胞，加入1.0 mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次。

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g 离心5 min。

3.取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5 min。

4.取上清，转移至新的离心管中，4℃， 12,000 g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。

5.往线粒体沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000 g 离心5 min。

6.取上清，转移至新的离心管中，4℃， 12,000 g 离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。

7.用50 -100μL Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。