产品名称：犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒

犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒

                                  使用说明书

                 （本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!）

声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品适用于体外定量检测狗血清、血 浆或其它相关生物液体中内皮糖蛋白(ENG)浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！

灵敏度、检测范围、特异性和重复性:

●灵敏度：*小可测 0.33ng/mL

●检测范围:0.781-50ng/mL

●特异性：可检测重组或天然的内皮糖蛋白(ENG)，且与其它相关蛋白无交叉反应。

●重复性：板内，板间变异系数均<10%。

犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒组成：

特别说明：

*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.

相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用内皮糖蛋白(ENG)抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品 中的内皮糖蛋白(ENG)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的内皮糖蛋白(ENG)抗体和 辣根过氧化物酶标记的亲和素。内皮糖蛋白(ENG)抗体与结合在包被抗体上的内皮糖蛋白(ENG)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根 过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，内皮糖蛋白(ENG)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中内皮糖蛋白(ENG)的浓度。

犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集 血液的试管应为一次性的无热原，无内**试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可 检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会 影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体 积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。 推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组 织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟， 取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测 具体处理方法可参考：

6.样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻 存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。

8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品*高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先 做预实验，以确定稀释倍数）。

犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒试验所需自备物品:

1.酶标仪(450nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.吸水纸

检测前准备工作:

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结 晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超 过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC)，试剂不能直接在37oC溶解。

2.标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50ng/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入150μL的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成不同的梯度,标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

。

4.生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配 制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作 浓度。当日使用。

5.酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制 100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。 当日使用。

犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如150μL/管）

洗涤方法:

1.自动洗板机：每孔加入洗涤液100μL，注入与吸出间隔60秒。

2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸 去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

注意事项：

1.保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强 光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。

2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成 任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按推荐温度存放！

3.加样：加样或加试剂时，**个孔与*后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间*好控制在 10分钟内。推荐设置复孔。

4.犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标 板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸 水。在读数前要注意**底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。

6.试剂配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较 小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用前1000转/分离心1min，以使附着管壁或瓶 盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗 体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请 **配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时，一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释 过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次 用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。

7.显色时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很 明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。

8.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

9.混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，*好使用微量振荡器(使用*低频率)，如无微量 振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10.**：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品 时，请按国家生物试验室**防护条例执行。

11.犬内皮糖蛋白(ENG)检测试剂盒不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）

12.试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！

结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准

品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度

为纵坐标，绘出标准曲线。

2.推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程

式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

操作概要

1. 实验前标准品、试剂及样本的准备；

2.加样（标准品及样本）50μL，37℃孵育30分钟；

3.洗板5次，加酶标试剂50ul，37℃孵育半小时；

4.洗板5次；加入显色液A，B各50ul,37℃孵育显色15分钟

5.加终止液50μL，立即450nm读数。

6.计算