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大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒使用说明书
(本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!)
声明:尊敬的客户,感谢您选用本公司的产品。本产品适用于体外定量检测大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中阿黑皮素原(POMC)浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分!
灵敏度、检测范围、特异性和重复性:
●灵敏度:*小可测0.051ng/mL
●检测范围:0.156-10ng/mL
● 特异性:可检测重组或天然的阿黑皮素原(POMC),且与其它相关蛋白无交叉反应。
● 重复性:板内,板间变异系数均<10%。
大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒组成:
中文名称 |
英文名称 |
规格 |
保存条件 |
ELISA 酶标板(可拆卸) |
Micro ELISA Plate(Dismountable) |
8×12 / 8×6 * |
4℃/-20℃ # |
标准品 |
Reference Standard |
2/1 支* |
4℃/-20℃ # |
标准品稀释液 |
Reference Standard & Sample Diluent |
1瓶 1.5ml * |
4℃ |
样品稀释液 |
Biotinylated Detection Ab Diluent |
1瓶 6mL/3mL * |
4℃ |
浓缩 HRP 酶试剂 |
Concentrated HRP Conjugate |
1支 6ml/3ml * |
4℃(避光) |
显色剂B液 |
HRP Conjugate Diluent |
1瓶 6mL/3mL * |
4℃ |
浓缩洗涤液(30×) |
Concentrated Wash Buffer (30×) |
1瓶20mL/12mL * |
4℃ |
显色剂A液 |
Substrate Reagent |
1瓶 6mL/3mL * |
4℃(避光) |
反应终止液 |
Stop Solution |
1瓶 6mL/3mL * |
4℃ |
封板覆膜 |
Plate Sealer |
2 张* |
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产品说明书 |
Product Description |
1份 |
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质检报告 |
Certificate of Analysis |
1份 |
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特别说明:
*: [96T/48T](打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整)
#: 一周内使用可存于4℃,需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些,请在使用时量取而非直接倒出!
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗阿黑皮素原(POMC)抗体包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的阿黑皮素原(POMC)会与包被抗体结合,游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗阿黑皮素原(POMC)抗体和 辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗阿黑皮素原(POMC)抗体与结合在包被抗体上的阿黑皮素原(POMC)结合、生物素与亲和素特异性结合而形成**复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB),TMB在辣根 过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值,阿黑皮素原(POMC)浓度与OD450值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中阿黑皮素原(POMC)的浓度。
大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒样品收集:
1.血清:全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集 血液的试管应为一次性的无热原,无内**试管。
2.血浆:抗凝剂推荐使用EDTA-Na2,样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可 检测。避免使用溶血,高血脂样品。
3.组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会 影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体 积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。 推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组 织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟, 取上清检测。
4.细胞培养上清:取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
5.其它生物样品:1000×g离心20分钟,取上清即可检测 具体处理方法可参考:
6.样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。
7.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻 存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融。
8.如果您的样品中检测物浓度高于标准品*高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议先 做预实验,以确定稀释倍数)。
大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒试验所需自备物品:
1.酶标仪(450nm波长滤光片)
2.高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3.37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
4.吸水纸
检测前准备工作:
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结 晶,属于正常现象,可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超 过50℃,使用时洗涤液应为室温)。当日使用。
1.使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25oC),试剂不能直接在37oC溶解。
2.标准品(冻干品):每瓶标准品加入标准品稀释液1mL,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10ng/mL。准备7个稀释标准品的EP管,每个EP管中加入150μL的标准品稀释液,如图所示依次倍比稀释成不同的梯度,标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
4.生物素化抗体工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计),实际配制时应多配 制100-200μL。使用前15分钟,以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作 浓度。当日使用。
5.酶结合物工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计),实际配制时应多配制 100-200μL。使用前15分钟,以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。 当日使用。
大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒标准品稀释方法图例:(以500μL/管为例,也可根据实际用量来稀释,如150μL/管)
洗涤方法:
1.自动洗板机:每孔加入洗涤液100μL,注入与吸出间隔60秒。
2.手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净的吸水纸上拍干,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸 去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。
操作步骤:
实验开始前,各试剂均应平衡至室温;试剂或样品配制时,均需充分混匀,并尽量避免起泡。
1.标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
5号标准品 |
150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 |
4号标准品 |
150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 |
3号标准品 |
150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 |
2号标准品 |
150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 |
1号标准品 |
150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 |
2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。
注意事项:
1.保存:试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强 光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染,否则可能会出现错误的结果。
2.酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成 任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋,按推荐温度存放!
3.加样:加样或加试剂时,**个孔与*后一个孔的加样时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预温育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间*好控制在 10分钟内。推荐设置复孔。
4.大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜;洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标 板处于干燥状态;严格遵守给定的温育时间和温度。
5.洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸 水。在读数前要注意**底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。
6.试剂配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较 小,运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用前1000转/分离心1min,以使附着管壁或瓶 盖的液体沉积到管底。取用前,请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗 体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请 **配制标准品及工作液,尽量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时,一次不要小于10μL),以避免由于不准确稀释而造成浓度误差;请勿重复使用已稀释 过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次 用量分装,将其放在-20~-80℃贮存。避免反复冻融。
7.显色时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔5分钟),如梯度已很 明显,请提前加入终止液终止反应,避免颜色过深影响酶标仪读数。
8.底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。
9.混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,*好使用微量振荡器(使用*低频率),如无微量 振荡器,可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
10.**:试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品 时,请按国家生物试验室**防护条例执行。
11.大鼠阿黑皮素原(POMC)检测试剂盒不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外)
12.试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用,严禁混用,否则将影响试验结果!
结果判断:
1.每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图,如设置复孔,则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标,标准品的浓度为纵坐标,绘出标准曲线。
2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或1.4,在软件界面既可根据样品OD值,由标准曲线查出相应的浓度,乘以稀释倍数;亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
3.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
操作概要:
1.实验前标准品、试剂及样本的准备;
2.加样(标准品及样本)50μL,37℃孵育30分钟;
3.洗板5次,加酶标试剂50ul,37℃孵育半小时;
4.洗板5次;加入显色液A,B各50ul,37℃孵育显色15分钟
5.加终止液50μL,立即450nm读数。
6.计算