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  • 产品名称:2×Hieff™ HS Pfu Master Mix

  • 产品型号:10116YB03
  • 产品厂商:YBscience
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简单介绍:
2×Hieff™ HS Pfu Master Mix是即用型的PCR预混合溶液,包含HieffTM HS Pfu DNA Polymerase,dNTP以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增,大大简化实验的操作步骤,提高了高通量操作和实验结果的重现性。2×Hieff™ HS Pfu Master Mix体系中含有的保护剂使得Master Mix 经过反复冻融后仍可维持稳定的活性。PCR产物为平末端。
详情介绍:

2×Hieff™ HS Pfu Master Mix

产品描述


2×HieffTM HS Pfu Master Mix是即用型的PCR预混合溶液,包含HieffTM HS Pfu DNA Polymerase,dNTP以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增,大大简化实验的操作步骤,提高了高通量操作和实验结果的重现性。体系中含有的保护剂使得Master Mix 经过反复冻融后仍可维持稳定的活性。PCR产物为平末端。


10116-A


2×HieffTM Pfu Master Mix


1 ml


1 ml×5


10116-B


超纯水(PCR Grade)


1ml


1 ml×5


2×Hieff™ HS Pfu Master Mix运输与保存方法


冰袋(wet ice)运输。收到产品后放到-20 ºC保存。


质量控制


核酸外切酶残留检测:20 μl本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。


核酸内切酶残留检测:20 μl本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。


大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中,以ddH2O为模板,扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,无扩增条带。


功能检测1:以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的8.2 kb条带。


功能检测2:以10 ng λDNA为模板扩增30个循环,取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的15 kb条带。


2×Hieff™ HS Pfu Master Mix应用实例


1.        反应体系配制:

ddH2O


Up to 50 μl


模板DNA§


optional


引物1(10 μM)


2 μl


引物2(10 μM)


2 μl


2×HieffTM HS Pfu Master Mix


25 μl


注:§ 针对不同模板的*佳反应浓度有所不同,下表为50μl反应体系推荐模板使用量,仅供参考。


模板种类/扩增长度


<1 kb


1 kb~10 kb


>10 kb


基因组DNA


50 ng~250 ng


100 ng~300 ng


150 ng~400 ng


2×Hieff™ HS Pfu Master Mix质粒或病毒DNA


10 pg~20 ng


10 pg~20 ng


1 ng~30 ng


cDNA


1~5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)


2.        一般PCR反应条件设置:


循环步骤


温度


时间


预变性a


95℃


30 sec~3 min


变性b


95℃


5~10 sec


25~35循环


退火c


45℃~72℃


10~30 sec


延伸d


72℃


15~30 sec/kb


彻底延伸


72℃


5~10 min


注:a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃, 时间为:质粒或病毒DNA,30 sec,基因组2 min,cDNA 3 min;对于高GC含量模板,预变性温度需提升至98℃,变性时间为2~4 min;对于超过10 kb的扩增子,预变性温度需降低至92℃,变性时间不超过2 min。


b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。


c. Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的*适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30 sec之间调整。


d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。


3.        长片段PCR指南:

*使用高质量的模板;


*使用长引物。将引物加长至Tm值68~72℃,把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性;


*推荐反应条件设置:


循环步骤


温度


时间


预变性


92℃


2 min


变性


92℃


5~10 sec


25~35循环


延伸


68℃


15~30 sec/kb


彻底延伸


68℃


5~10 min


4.        高GC含量模板PCR指南:

*使用高质量的模板;


*提高变性温度至98℃;


*推荐反应条件设置:


循环步骤


温度


时间


预变性


98℃


3 min


变性


98℃


10 sec


25~35循环


退火


45℃~72℃


10~30 sec


延伸


72℃


15~30 sec/kb


彻底延伸


72℃


5~10 min


2×Hieff™ HS Pfu Master Mix引物设计注意事项


1)引物3’端*后一个碱基*好为G或者C;


2)引物3’端*后8个碱基应避免出现连续错配;


3)引物3’端尽量避免发夹结构出现;


4)引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。


5)引物额外附加序列,即与模板非配对序列,不应参与引物Tm值计算;


6)引物的GC含量控制在40%-60%之间;


7)正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。


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