产品名称： HieffTMII Pfu DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

产品描述

Hieff^TMII Pfu DNA Polymerase 是基于Hieff^TM Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/53，是Pfu酶的1/6；

与上一代Hieff^TM Pfu DNA Polymerase相比，Hieff^TMII Pfu中添加了独特的延伸因子、特异性促进因子以及平台期解抑制因子，使其长片段扩增能力、扩增特异性性以及扩增产量方面得到了大幅度提升：1）使用λDNA、质粒等简单模板，Hieff^TMII Pfu可以有效扩增长达40 kb的片段；2）使用基因组DNA等复杂模板，Hieff^TMII Pfu可以有效扩增长达20 kb的片段；3）使用cDNA模板，Hieff^TMII Pfu可以有效扩增长达10 kb的片段。此外，Hieff^TMII Pfu对PCR抑制剂具有良好的抵抗能力，可用于**、**、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。Hieff^TM II Pfu中添加了在常温下能够抑制其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。

HieffTMII Pfu DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶活性定义

用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。 

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。有效期1年。

HieffTMII Pfu DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶质量控制

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH₂O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。

功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。

功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

1 推荐反应体系及反应程序

1.1 反应体系配制：

所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶*后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。

【注】：a. 2×Hieff^TM II PCR buffer中已含有Mg²⁺，终浓度为2mM。

b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。

c. 不同模板*佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：

d. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将酶的使用量在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性，因此，如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。

1.2 一般PCR反应条件设置：

HieffTMII Pfu DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶【注】：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组/cDNA为3 min；

b.一般来说，退火温度设置为引物Tm值。如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找*适引物模板结合温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度，每次+3℃。

c.延长延伸时间有助于提高扩增产量。

1.3 长片段PCR 扩增：

*使用高质量的模板，提高模板使用量；

*使用长引物。

*当推荐程序无法进行扩增时，建议尝试下述Touch Down两步法PC