产品名称：Picogreen dsDNA Assay Kit 双链DNA定量检测试剂盒

产品描述

Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建，DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义，疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。

常用的检测核酸的方法有:1）紫外吸光法（A₂₆₀），该法操作简便，但DNA样品中核苷酸、单链DNA、RNA和蛋白质对紫外吸收信号影响很大，还容易受到核酸样品中污染物的干扰，不能区分DNA和RNA，而且灵敏度低（ΔA₂₆₀=0.1相当于5ug/ml的dsDNA）；2）探针杂交法，该法是传统检测微量DNA的常用方法，基本能满足目前疫苗和**性生物制品的检测需求，但是该法耗时较长，操作繁琐，稳定性、敏感性和特异性较差；3）Hoechst33258染料法，Hoechst33258是一种一定程度上特异于双链DNA的核酸染料，基本不受蛋白质等污染物的干扰，可以检测低至10ng/ml的DNA；在检测稳定性和灵敏度上仍达不到理想效果。

Picogreen dsDNA定量法：Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以**地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。

相比传统的方法，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：①灵敏度高：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省宝贵的样品；②特异性强：在等摩尔的RNA存在的条件下，对dsDNA具有特异性；③耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。④易于使用——只需在样品中加入染料，等待5分钟，然后读数即可，且适用于96和384孔板；与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。⑤适用范围广：可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。

若每次分析体积为2 mL，本试剂盒各组分试剂足够200次分析使用，若使用微孔板或96孔板检测，每次使用量200µl，则各组分试剂足够2000次分析。

Picogreen dsDNA Assay Kit 双链DNA定量检测试剂盒试剂准备

1）1×TE buffer 的配制：将2×TE 用无菌去离子水（不含Dnase）等体积稀释至1×工作液。

2）PicoGreen工作液的配制：使用前将PicoGreen dsDNA定量试剂回温至室温；PicoGreen是以100µL 200×的浓缩液形式保存于无水DMSO中的（共10管）。实验当天，根据实验需求用1×TE按1:200 的比例稀释适量定量试剂浓缩液。例如要准备足够的操作溶液以2ml检测体系测定20个样品，可向19.9mL1×TE 中加入100μL PicoGreen dsDNA 定量试剂。

【注】：a、由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。

b、PicoGreen 试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用铝箔包住或放置暗处避光保存。

c、溶液*好在配制好数小时内使用，以保证*佳结果。

检测步骤

1、 2µg/ml的Calf thymus DNA standard浓缩液的配制

用1×TE对Calf thymus DNA standard (100µg/ml)进行50倍稀释，即向30µl Calf thymus DNA standard加入1.47ml 1×TE混匀即可。

2、 标准曲线的制备

① 比色皿体系检测---（2ml）

a、按照表1 向一次性微量比色皿中加入TE和2µg/ml Calf thymus DNA standard，随后加入1ml PicoGreen定量试剂，混匀后，于室温避光孵育2-5min，并以1×TE缓冲液为blank。【注】：确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。

表1 比色皿体系所需加入各组分量及标准品终浓度表

b、于荧光仪中检测各浓度荧光值，Ex/Em=480nm/520nm。

Picogreen dsDNA Assay Kit 双链DNA定量检测试剂盒【注】：为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内，应调节增益使含*高DNA浓度的样品荧光值与荧光仪的*大值一致；为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。

c、各浓度得到的荧光值减去空白对照荧光值，对DNA浓度和荧光值做标准曲线。

② 微孔板体系检测（200µl）

a、按照表2 向96孔板中加入TE和2µg/ml Calf thymus DNA standard，随后加入100µl PicoGreen定量试剂，混匀后，于室温避光孵育2-5min，并以1×TE缓冲液为blank。【注】：确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。

表1 酶标板体系所需加入各组分量及标准品终浓度表

b、于荧光酶标仪中检测各浓度荧光值，Ex/Em=480nm/520nm。

 【注】：为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内，应调节增益使含*高DNA浓度的样品荧光值与荧光仪的*大值一致；为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。