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Hieff™ I Reverse Transcriptase **代耐热逆转录酶
产品描述
HieffTM I Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。HieffTM Reverse Transcriptase热稳定性提高，在
Hieff™ I Reverse Transcriptase **代耐热逆转录酶活性定义
以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在
Hieff™ I Reverse Transcriptase **代耐热逆转录酶运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。
Hieff™ I Reverse Transcriptase **代耐热逆转录酶质量控制
核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1小时，RNA电泳谱带不发生变化。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，50 ºC反应45分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增DNCH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的5.6 kb条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，50 ºC反应30分钟。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
Hieff™ I Reverse Transcriptase **代耐热逆转录酶注意事项
1）请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free，以防止RNase污染。
2）为保证逆转录成功，建议使用高质量的RNA样本。
3）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。
应用实例
1. RNA模板变性
【注意】RNA模板变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高**链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请务必进行此步操作。对于GC含量很高（50%以上）建议也进行此步操作。
RNase free离心管中配制如下混合液【表1】，65℃ 加热5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min。
表1 模板RNA变性混合体系
2. **链cDNA合成体系
在RNase free离心管中配制如下混合液【表2】：
表2 **链cDNA合成反应体系
3. 按照下列条件进行**链合成反应：
使用Oligo(dT)18
[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。对于Oligo(dT)18引物，要在55℃逆转录。需要先在42℃孵育5min，然后在55℃孵育50min。
[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。
使用Random hexamers
[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。
[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。
使用Gene Speicific Primers
[*]：当模板GC含量高（50%以上）或者二级结构复杂，可将逆转录温度提高到55℃。
[**]：65℃加热15min的目的是失活逆转录酶。
得到的**链cDNA反应产物可立即用于PCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。用于PCR反应的cDNA产物体积建议取PCR反应体积的1/10-1/5。
