产品名称：Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒

实验流程概览

Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒1.        引物设计

向质粒三个不连续位点引入定点突变，只需设计三对引物将质粒分段扩增即可。引物设计基本原则为：在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对。每对正反向扩增引物5’端包含至少20 bp反向互补区域。所需引入突变可以包含在互补区域内 (需要两条引物上均引入点突变)，也可以包含在任一条引物的非互补区域 (只需在一条引物上引入点突变)，请勿将突变位点置于引物末端。以向pUC18引入单碱基突变为例，引物设计具体方案如图二所示。

注意：待突变位点B、C处的正反向扩增引物设计方式与位点A 处的引物设计方式一致。计算引物Tm值时，应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基，待突变位点至引物5’端区域内的碱基不应参与计算。

2.       1.        目标质粒分段扩增

以待突变位点A、B、C为界，将质粒分为AB、BC段和CA段。使用Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase对各段分别进行扩增。AB段扩增引物对为：待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反向扩增引物；BC段扩增引物对为：待突变位点B正向扩增引物和待突变位点C反向扩增引物；CA段扩增引物对为：待突变位点C正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物。

2.1 配制PCR反应体系

反应各组分解冻后请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。2×Hieff^TM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。

为了增加扩增特异性，反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶*后加入反应体系中。

推荐反应体系如下：

a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。

b 在各片段能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量，推荐≤1 ng。待扩增质粒长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，因此推荐使用新鲜制备的质粒作为模板。

c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化，但不要超过2 U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。

2.2 PCR扩增反应

推荐PCR反应条件：

a. 对于大多数质粒，变性温度使用95℃即可。

b. Hieff^TM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的*适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。

c. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。

d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变，强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应≤30。

反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增，则可进行下步实验。

2.        扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒

因上述扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。

推荐反应体系如下：

将上述反应体系置于37℃恒温反应1～2小时。如产物扩增特异，产物条带单一，DpnI消化产物无需纯化，可直接用于后续重组反应。如扩增不特异，DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。

3.        重组反应

4.1 配制重组反应体系

质粒AB、BC和CA段扩增产物末端分别包含相对应的完全一致的一段序列，因此在Exnase MultiS催化下三扩增产物末端可以发生同源重组，完成扩增产物环化过程。于冰水浴中，将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。

Exnase MultiS多点突变重组反应体系*适DNA使用量为每片段0.03 pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

DpnI消化产物*适使用量 = [0.02 × 目标质粒碱基对数] ng (0.03 pmol)

例如，AB段长度为1 kb，BC段长度为2 kb，CA段长度为5 kb。则DpnI消化产物*适使用量为：AB段0.02 × 1000 = 20 ng；BC段0.02 × 2000 = 40 ng；CA段0.02 ×5000 = 100 ng。

Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒【注】：DNA量太多或者太少都将降低环化效率。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差较大。因此，请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度，尽量严格按照推荐量配制反应体系。当DpnI消化产物*适使用量计算值不足10 ng或者超过200 ng时，加入10ng或200 ng即可。DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时，使用量不应超过反应总体积的1/5，即4μl。

4.2 重组反应

1）     将上述体系置于37℃反应 30 min。

2）     待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。

3）     之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

4.          反应产物转化、涂板、克隆鉴定

1）     取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。

2）     42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3）     加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。

4）     37℃摇菌45 min。

5）     取100 μl菌液均匀涂布在含有适当***的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

【注】：我们推荐您使用转化效率>10⁸ cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<10⁸ cfu/μg (例如用CaCl₂法新鲜制备的感受态转化效率通常在10⁶-10⁷ cfu/μg之间)，请将培养菌液在5,000 rpm离心3 min收集菌体，用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。

Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒注意事项

1）     引物设计时5’端反向互补区尽量选择无重复序列，且GC含量比较均匀的区域。当这一区域内GC含量在40%～60%范围之内时，重组环化效率将达到*大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组环化效率会受到较大影响。

2）     当两突变位点相距小于50bp时，应将其视为一个突变位点，将两突变引入同一条/对引物进行实验。

3）     DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。

4）     质粒PCR扩增结果需高度特异，杂带较多会影响实验结果。

5）     重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(如EDTA)的带入。因此，建议将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH₂O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH₂O替代)，请勿使用TE进行DNA保存。

6）     冷却后的反应产物应在1h内进行转化，且转化前保持在冰水浴中。如需储存，于-20℃冻存。尽量避免室温较长时间放置或4℃长期储存。

7）     反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。另外，当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

8）     为了您的**和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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