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Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶
产品描述
HieffTM Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的，新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。
本产品中附带的5 × Phanta SF反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1 × 终浓度为2 mM)，可以使用产品中提供的DMSO或MgSO4对反应体系进行优化。另外，产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶产品特点：
• 保真度是Taq DNA Polymerase的52倍
• 扩增速度是常规聚合酶的4-150倍
• 广泛的模板适应性
• 优化的缓冲体系广泛适用于各种类型模板，便于快速得到理想的扩增结果
• 提供PCR Enhancer以帮助扩增高GC含量的模板
• 提供即用型的预混液，*大程度地减少实验步骤
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶产品组分
活性定义
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃ 30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。
质量控制
核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。
引物设计注意事项
1）引物3’端*后一个碱基*好为G或者C；
2）引物3’端*后8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；
4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶应用实例
1.反应体系配制：
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HieffTM Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶*后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5 × SF Buffer请勿长时间敞口放置。
注：a. 对于大多数PCR反应，Mg2+*佳终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+，如有需要，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+*佳使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用；可能会降低保真度。
e. 不同模板*佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将HieffTM Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。HieffTM Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
2. 一般PCR反应条件设置：
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶注：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃， 时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组2 min，cDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec。
c. HieffTM Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的*适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30 sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组, cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
Hieff™ Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶3. 长片段PCR指南：
*使用高质量的模板；
*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；
*适当提高酶量，但50 μl反应体系内不要超过2 U；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～6%；
*推荐反应条件设置：
4. 高GC含量模板PCR指南：
*使用高质量的模板；
*提高变性温度至98℃；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～8%；
*添加5 × PCR Enhancer；
*推荐反应条件设置：
5. PCR反应体系优化方案实例（使用新引物初次扩增目标片段时可参照下述方法优化反应体系）：
对于常规PCR反应，引物浓度、dNTP浓度、酶浓度、模板浓度、Mg2+浓度可不做特别调整，使用前述一般推荐用量即可。当使用新引物初次扩增目标片段时，可使用随酶提供的两种添加剂 (DMSO、5 × PCR Enhancer)对反应体系进行初步优化。多数目标片段通过这一优化即可建立良好的扩增体系。下面以人基因组为模板扩增6 kb片段为例 (引物退火温度59.2℃)，推荐实验方案为：
扩增产物电泳检测结果为：
如图所示，当退火温度为56℃时，在反应体系中添加DMSO可显著提高扩增效果；当退火温度为60℃时，在反应体系中添加5 × PCR Enhancer可显著提高扩增效果。如引物二聚体不影响实验结果（回收后用于克隆），再次扩增时使用以上两条件之一即可；如需去除引物二聚体，可在此基础上做进一步优化。
