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Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒
产品描述
试剂盒中包含2 × Blood Master Mix，其中的血液DNA聚合酶专为全血DNA直接扩增而设计，对全血样品中的PCR抑制剂具有超强的抵抗力，可扩增全血浓度高达40%。高度优化的反应体系使得Blood direct PCR Kit能够从全血样品中高效扩增长达7.5 kb的基因组片段。扩增产物为平端，适用于HieffCloneTM快速克隆试剂盒 (11001ES25/ 11002ES10)。另外，试剂盒中配有与哺乳动物和其他许多脊椎动物兼容的引物预混液Positive control primer mix，可用于进行阳性对照反应。
该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括：新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干血渍，且兼容所有常规抗凝剂 (EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。Blood Direct PCR Kit已经在许多哺乳动物物种上进行了成功测试，并成功扩增了几种禽类全血。
*包含Blood Super-Fidelity DNA Polymerase、dNTPs and Mg2+。
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。
质量控制
50 μl PCR体系中，以5 μl人全血为模板扩增7.5 kb片段。35个循环后将1/10 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.5 kb条带。
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒注意事项
1) 推荐血液模板使用量为反应总体积的1/10，即50 μl的反应体系内加入5 μl全血。如全血使用体积超过反应总体积的1/10，可能需要进一步调整Mg2+浓度。
2) 吸取抗凝血，尤其是长期存放过的抗凝血时，应尽量避免吸取血液凝块。
3) 延伸时间按30 sec/kb设定，请勿使用更长的延伸时间。
4) PCR完成后，推荐将反应液于1,000 × g (大约4,000 rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。
全血扩增引物设计注意事项
1) 引物3’端*后一个碱基选择C或G；
2) 引物3’端*后8个碱基应避免出现连续错配；
3) 引物3’端尽量避免出现发夹结构；
4) 引物Tm值控制在60℃-72℃之间 (推荐使用软件Primer Premier 5进行计算)；
5) 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6) 引物GC含量控制在40%-60%之间；
7) 正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒操作方法
1. 反应体系配制：
所有组分解冻后请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。
a. 推荐每条引物使用终浓度为0.4 μM，引物使用量太多会导致非特异性扩增增加。
b. *适全血模板浓度范围为1%～20%，推荐使用10%作为初始尝试条件，尽量避免吸取血液凝块。如果样本是贮存在Whatman滤纸卡上的干血渍，则可取约1mm2带血渍的圆纸片，将其直接放入PCR反应液中，无需预处理。
注1：对于禽类和血细胞中带细胞核的其他物种，可能需要减少用于PCR反应的血量。
注2：全血若短期贮存 (少于3个月)，可置于4℃；若长期贮存，推荐存于-20℃或者Whatman FTA®/903®卡上。
c. 对于使用全血模板的大多数PCR反应，Mg2+*佳终浓度为2 mM。2 × Blood Master Mix已含有终浓度为2.0 mM 的Mg2+。但Mg2+的*佳浓度会随引物、反应中的血液浓度和所用贮存卡的种类的不同而改变。如推荐反应体系无法正常扩增时，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+*佳使用浓度。
d. 5 × Blood Enhancer是全血扩增专用增强剂，可以有效降低甚至消除全血中PCR抑制因子对扩增反应的干扰，增强GC-rich扩增子的扩增效果。如推荐反应体系无法正常扩增时可尝试添加。
e. 2 × Blood Master Mix中包含Blood Super-Fidelity DNA Polymerase，是一种带有校对活性的高保真聚合酶，其保真度是普通Taq聚合酶的52倍。预混液中添加了可以在常温下封闭其外切酶和聚合酶活性的单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。
注1：Blood Super-Fidelity DNA Polymerase具有较强的校对活性，扩增产物为平末端。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
2. PCR反应条件设置
a. 预变性(95℃，5min)可以让白细胞裂解，释放可用于PCR扩增的基因组DNA。 请勿缩短时间或降低温度。
b. Blood Super-Fidelity DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值即可。然而，使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增，并提高全血模版的扩增效率。因此，如扩增产物特异性较差，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板*适退火温度。推荐退火时间设置为5 sec
即可。
c. 延伸时间按30 sec/kb设定，请勿使用更长的延伸时间。
d. 一般而言，35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加，且有可能会降低扩增保真度。
注：如退火温度高于68℃，可将退火过程和延伸过程合并，进行两步法PCR。温度设定为退火温度(如高于72℃，则设置为72℃即可)，时间设置为30 sec/kb。
3. 扩增产物分析
PCR完成后，建议将反应液于1000 × g (大约4000rpm) 离心1～3 min以沉淀血细胞碎片，之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要，因为经过PCR循环，反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测，如琼脂糖电泳检测。若需对PCR产物进行酶切分析(PCR-RFLP)，应预先将其稀释2～4倍，以去除存在于PCR反应液中的盐及其它抑制剂对酶切反应的干扰。
4. 对照反应
试剂盒中提供引物预混液Positive control primer mix(10 μM each)用于阳性对照反应。可从哺乳动物及其他许多脊椎动物的基因组中扩增237 bp的片段。该扩增区位于sox21基因的上游，是一段高度保守的非编码区。
Primer #1 (24-mer) 5’- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3’
Tm: 73.5°C
Primer #2 (27-mer) 5’- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3’
Tm: 72.2°C (R=A), 75.3°C (R=G)
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒4.1 反应体系
4.2 PCR反应条件设置
