WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜),并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针,抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免yi反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析,旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。下面了解蛋白提取过程:
常规的样品无外乎3种,分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解,细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来,随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等,这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用,可将细胞膜或核膜裂解,释放其中的物质。同时,裂解液中还包含其它成分,如Tris-Hcl作为缓冲剂,可防止蛋白在提取过程中变性;以及Nacl,可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司**的裂解液成分大同小异,多是以上成分按不同比例组成,可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。