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WB蛋白提取过程

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜),并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针,抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免yi反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析,旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。下面了解蛋白提取过程:

常规的样品无外乎3种,分别是培养的细胞、动物组织(磨碎或剪碎至肉眼观察无颗粒)、术中切割的肿瘤细胞。这些样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解,细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来,随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等,这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用,可将细胞膜或核膜裂解,释放其中的物质。同时,裂解液中还包含其它成分,如Tris-Hcl作为缓冲剂,可防止蛋白在提取过程中变性;以及Nacl,可防止提取的蛋白由于非特异性的聚集而形成聚体等。不同公司**的裂解液成分大同小异,多是以上成分按不同比例组成,可分为弱、中、强三种不同裂解能力的裂解液。

重要的是我们要清楚自己研究的蛋白到底在细胞哪里表达,是细胞膜、胞浆还是细胞核。这决定我们该使用哪种强度的裂解液。如果裂解不充分,我们抽提的总蛋白中可能已经不包括目标蛋白或目标蛋白随着沉淀物被丢弃,那么整个WB实验从一开始就悄无声息地失败了。