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荧光定量PCR对标准品要求

荧光定量PCR检测的是起点荧光值,定量分析的是未经PCR放大之前的起始模板量。

这就涉及到荧光定量PCR的第2个关键点——定量方式的选择:相对定量和绝dui定量。

dui定量可测定目的基因在样本中的具体拷贝数,相对定量测定的是目的基因在两个或多个样本中的相对表达水平,定量方式的选择取决于实验目的。

dui定量必须使用已知浓度/拷贝数的标准品制作标准曲线,
dui定量对标准曲线的准确度要求较高,相对来说对标准品的要求也比较高。

标准品的要求:

(1)标准品与待测样本用相同的引物进行扩增,确保引物在两者中扩增效率相同。

(2)标准品来源可以是基因组DNA,质粒DNA,纯化的PCR产物,Total RNA(cDNA),体外转录的 RNA等,其中基因组DNA和Total RNA(cDNA)不能直接用作标准品。

(3)标准品必须经过准确定量,其拷贝数必须已知。

(4)标准品与待测样本要在同一次实验以及相同的条件下完成,扩增效率尽量接近。

标准曲线的制作:

将标准品稀释5~6个浓度梯度,稀释倍数可以选择5倍(cDNA)或10倍(质粒DNA、体外转录RNA)。