注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)是机体胶原蛋白主要成分之一,胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
测定原理:
样品经水解产生游离的HYP,进一步被氯胺T氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物,在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值,可计算HYP含量。
羟脯氨酸含量计算公式:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按样品重量计算
组织羟脯氨酸含量(mg/g 鲜重)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.154×(ΔA-0.0251)÷W
(2)按xi 菌或细胞密度计算
细胞羟脯氨酸含量(mg/104 cell)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)= 0.077×(ΔA-0.0251)÷ 细胞数量(万个)
(3)按血清体积计算
HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷ 64.875×V反总÷V样×2
=0.154×(ΔA-0.0251)
V反总:反应总体积,0.3 mL;V样:反应中样品体积,0.06mL;V样总:加入提取液体积, mL;W:样本重量,g
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=32.4375x+ 0.0251,R2=0.9991
HYP含量(mg/g 鲜重)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.308×(ΔA-0.0251)÷W
HYP含量(mg/104 cell)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)= 0.154×(ΔA-0.0251)÷细胞数量(万个)
HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反总÷V样×2
= 0.308×(ΔA-0.0251)
V反总:反应总体积,0.3 mL;V样:反应中样品体积,0.06mL;V样总:加入提取液体积, mL;W:样本重量,g;2,血清吹干后复溶的倍数。
注意事项:
1、吸光值大于0.8,样品适当稀释再测定,注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、试剂有一定的毒性,请操作时做好防护措施,防止吸入或与皮肤接触。
3、zui 低检出限为3.8mg/L。