PCR反应需要以双链DNA作为模板,因此初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段,但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达,此外由于真核生物的基因中存在内含子,直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因,针对这一问题,发展出了逆转录PCR的技术。
RT-PCR技术原理:
逆转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR) 是以mRNA为模板,在逆转录酶作用下合成cDNA,之后再进行PCR的过程。
逆转录反应体系:
1. RNA模板
通常20μL的逆转录体系,加入总RNA 1μg,如果总RNA加入过多,会导致逆转录不充分。
2. 引物
常用的有随机引物和Oligo(dT)引物:
随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录,此时得到的cDNA大部分来源于rRNA,主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用;
Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配,可以特异性的对mRNA进行逆转录。
3. 逆转录酶 逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程,目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能,因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可,而不需额外加入DNA聚合酶。
4. 4种dNTPs