封闭是Western Blot 至关重要的一部分, 所以正确的封闭液选择可以让抗体更特异地和抗原结合,为成功的WB奠定基础。虽然这个步骤操作简单,但是封闭液的选择确是很多科研人员的难题。为了让大家更方便的选择适合自己实验的封闭液,这里介绍6种常见不同的封闭液,以及它们的优缺点。
封闭液的选用要求:
1、常用封闭液为脱脂牛奶(光明或伊利等)、牛血清白蛋白(BSA)、无蛋白封闭液等。
2、封闭液浓度:封闭时一般用5%脱脂牛奶,也可用1-5%BSA或1%无蛋白封闭液;配制二抗稀释液一般为1-5%脱脂牛奶,全部用PBS稀释。
3、封闭时间:室温1-2h、4度过夜或37度半小时。
4、封闭液pH:一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右,而1%脱脂牛奶可能6.5-7,好像RD公司的WB-Protocol中要求封闭液和稀释抗体的封闭液需要调pH至7.4;但是大多数抗体不调pH也可以做出来。
5、个人经验:5%脱脂牛奶封闭效果佳,但有时也可能封闭过度,可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。